血清中5種維生素水平與阿爾茨海默病相關(guān)性研究

朱金峰 黨瑞 崔宇 王超 解微 王德才

血清中5種維生素水平與阿爾茨海默病相關(guān)性研究

朱金峰 黨瑞 崔宇 王超 解微 王德才

目的 基于高效液相色譜法測定阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者血清中維生素A、D3、B1、B2、B12的水平,并探討與AD的相關(guān)性。 方法 采用橫斷面病例對照研究,測定110例AD患者及130例健康對照血清中維生素A、D3、B1、B2、B12的水平。維生素A、D3測定用甲醇沉淀蛋白,正己烷提取,氮吹濃縮,無水乙醇定容，維生素B1、B2、B12用C18 小柱提取,甲醇/水(80%)定容，高效液相色譜儀紫外檢測器(HPLC-UVD)測定。 結(jié)果 AD患者血清中維生素A、D3、B1、B2、B12的水平與正常人有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論 AD 的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸與維生素A、D3、B1、B2、B12密切相關(guān),提示在預(yù)防治療AD中進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)有一定的實(shí)際意義。

維生素; 阿爾茨海默病; 高效液相色譜法

隨著社會老齡化迅速發(fā)展,阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)病率急劇上升,嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量,并給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。AD典型的病理學(xué)特征為老年斑(senile plaques,SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)、神經(jīng)元減少及顆?？张葑冃缘萚1]。目前對AD的治療沒有特效藥和具體方法,只能是延緩病情的發(fā)展。因此采取積極的早期營養(yǎng)干預(yù),預(yù)防AD疾病的發(fā)生和發(fā)展備受關(guān)注。該文旨在通過檢測AD患者血清中維生素A、D3、B1、B2、B12的水平,探討5種維生素水平與AD的發(fā)生以及病程發(fā)展之間的關(guān)系,為AD早期的預(yù)防治療及營養(yǎng)干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑 高效液相色譜儀6110(美國Agilent科技有限公司),-80 ℃超低溫冰箱,Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司),微型漩渦混勻器, LD5-2A 型臺式高速離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠),Sep-park C18小柱 (Waters,美國)。

甲醇(色譜純,山東禹王試劑公司),無水乙醇(分析純,天津光復(fù)試劑有限公司),磷酸二氫鉀(分析純,天津光復(fù)試劑有限公司),鹽酸(分析純,天津光復(fù)試劑有限公司),維生素A、D3、B1、B2、B12標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,美國)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(>18MΩ/cm)。

1.2 受試對象的選擇 采用橫斷面病例對照研究調(diào)查方法,按照美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(NINCDS-ADRDA)診斷標(biāo)準(zhǔn),以及美國精神醫(yī)學(xué)會的《精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊》第4版(DSM-Ⅳ)診斷標(biāo)準(zhǔn),對黑龍江省墾區(qū)9個(gè)分局64個(gè)敬老院,年齡60～100歲老人,由醫(yī)院專業(yè)醫(yī)師診斷,結(jié)合調(diào)查問卷結(jié)果篩選符合AD標(biāo)準(zhǔn)的患者(病例組)110例,男43例,女67例,平均年齡(77.0±6.3)歲。同時(shí)選取在敬老院療養(yǎng)的健康老人130例為對照組,男65例,女65例,平均年齡(77.0±7.3)歲。所有研究對象均簽署知情倫理同意書,自愿參加和退出,自愿接受問卷調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室等與疾病相關(guān)的檢查。2組間年齡和性別具有可比性。

1.3 受試對象血樣采集及保存 用75%醫(yī)用酒精依次擦拭受試對象采血部位,抗凝管采集受試對象的清晨空腹肘靜脈血,4 ℃保存立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理。4 ℃下12000 r/min離心10 min,取上層黃色半透明狀液體血清樣本,分裝后,-80 ℃保存,待測。

1.4 操作步驟

1.4.1 樣品前處理:維生素A、D3:從-80 ℃冰箱中取出冷凍血清樣品,室溫解凍,置渦旋振蕩器振蕩30 s混勻,取100 μl血清置2 ml離心管中, 加入100 μl 甲醇,渦旋混勻1 min,靜置10 min,加入正己烷700 μl,渦旋混勻,12 000 r/min離心10 min,吸取上層正己烷350 μl,氮?dú)獯祾咧帘M干,加 200 μl無水乙醇復(fù)溶,渦旋1 min轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中,待測。

維生素B1、B2、B12:將Sep-park C18小柱先后用 6 ml 甲醇和 6 ml 去離子水活化處理。吸取 200 μl血清注入C18小柱內(nèi),加壓緩慢將血清注入小柱,保留一段時(shí)間,用10 ml pH 7.0 磷酸鹽緩沖液洗去殘留血清和其他雜質(zhì),2 ml 甲醇/水(80%)的洗脫液進(jìn)行洗脫,氮?dú)獯祾咧帘M干,用0.2 ml 甲醇/水(80%) 定容,轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中,待測。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制:準(zhǔn)確稱取一定量維生素A、D3的標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 ml容量瓶中,用無水乙醇溶解并稀釋至刻度,濃度為10 μg/ml的儲備液,再移取儲備液用無水乙醇梯度稀釋為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,取100 μl加入進(jìn)樣瓶中待測。

準(zhǔn)確稱取一定量維生素B1、B2、B12的標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 ml容量瓶,用 0.1 mol/L 鹽酸溶液配制成10 μg/ml的儲備液,再移取儲備液用0.1 mol/L 鹽酸溶液梯度稀釋為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,取100 μl加入進(jìn)樣瓶中待測。

1.4.3 色譜分析條件:本試驗(yàn)通過對不同比例流動相進(jìn)行篩選,確定最佳色譜條件,見表1。

表1 高效液相色譜最佳色譜分析條件

1.5 測定 在儀器最佳測定條件下,測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)對處理過的血樣測定,以相對保留時(shí)間定性,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得回歸方程,計(jì)算樣品中5種維生素的濃度。

1. 6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 檢測方法的質(zhì)量控制

2.1.1 線性范圍與檢測限:按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟配制維生素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,測定5種維生素的檢出限、回歸方程及相關(guān)系數(shù)。從表2可見,5種維生素檢出限均低于0.207 μg/ml, 相關(guān)系數(shù)均大于0.999, 表示出良好的線性關(guān)系。

2.1.2 回收率及精密度：本試驗(yàn)對方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了考察,在血清樣品中加入高、中、低 3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物檢測,維生素A、D3、B1、B2、B12的回收率分別為(96.167±7.028) %、(95.572±8.593) %、(96.277±8.684) %、(92.911±8.018) %、(91.672±8.087) %;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為(2.767±1.629) %、(2.322±1.625) %、(1.922±1.464) %、(2.678±1.306) %、(2.928±1.057) %,說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.2 2組維生素水平比較 對照組血清中維生素A、D3、B1、B2、B12的含量均高于病例組(P<0.01)。見表3。

表2 5種維生素檢出限、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表3 病例組與對照組血清檢測結(jié)果

注:與病例組比較,**P<0.01

3 討論

維生素在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,如果機(jī)體長期缺乏維生素,會導(dǎo)致酶的活性降低和抗氧化能力減弱,在一定程度上增加AD病人的氧化應(yīng)激反應(yīng),加重病程的進(jìn)展,使神經(jīng)元細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化而產(chǎn)生大量的氧自由基[1],這些氧自由基可以促進(jìn)Aβ的毒性和聚集,導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變而加劇AD的病情[2]。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)[3-4],它們能夠消除氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的有害物質(zhì)O2-和H2O2,阻止過氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的生成。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)病例組中維生素A明顯低于對照組,這可能因?yàn)橹苄跃S生素A容易進(jìn)入細(xì)胞膜,在細(xì)胞膜上發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),淬滅 O2-和H2O2,降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使抗氧化能力下降。李權(quán)超等[5]曾報(bào)道維生素A缺乏會導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)SOD 和GSH-Px的含量下降,神經(jīng)元細(xì)胞中的 MDA得不到及時(shí)的清除而大量堆積,加重氧化應(yīng)激反應(yīng),增加AD的風(fēng)險(xiǎn)。維生素D3通過神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的維生素D3受體,直接將25-(OH)D3轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?,25-(OH)2D3,提升γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的含量[6],增加還原型谷胱甘肽水平。還原型谷胱甘肽是一種抗氧化劑,能夠促進(jìn)SOD的合成,加速自由基的清除[7]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示對照組中的維生素D3明顯高于病例組,進(jìn)一步說明維生素D3的缺乏可能會加速AD的進(jìn)展。維生素B1、B2在氧化代謝平衡方面能夠以酶促反應(yīng)的形式生成還原型谷胱甘肽,維持SOD和GSH-Px的活性[8],降低過氧化物MDA 的含量,減弱氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷,本研究測定AD患者血清中維生素B1、B2的水平均低于對照組,說明維生素B1、B2的缺乏可能會使AD患者腦內(nèi)氧化代謝異常,還原型谷胱甘肽水平降低,細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加重,過氧化物MDA得不到及時(shí)的清除而大量堆積,致使AD患者病情進(jìn)一步加重。維生素B12是蛋氨酸合成酶的輔酶,可催化同型半胱氨酸(Hcy)甲基化生成蛋氨酸的反應(yīng),期間必須有5-四氫葉酸作為甲基供體,如果體內(nèi)缺乏維生素B12,5-甲基四氫葉酸上的甲基不能轉(zhuǎn)移,阻礙蛋氨酸的生成,從而造成Hcy在體內(nèi)的蓄積,Hcy可通過激活離子型或代謝型谷氨酸受體,引起大量的鈣離子內(nèi)流,致使鈣超載,損傷線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞氧化代謝功能障礙。Hcy還可以抑制GSH-Px、SOD的活性,減少活性氧的清除[9],提高腦神經(jīng)細(xì)胞對Aβ的敏感性,導(dǎo)致AD患者學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)元死亡[10]。本研究病例組維生素B12含量顯著低于對照組,說明維生素B12的缺乏會間接地導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的加重。

綜上所述,人體內(nèi)維生素A、D3、B1、B2、B12的缺乏可造成認(rèn)知功能障礙和記憶損傷,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其協(xié)同作用與AD疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),因此,采用復(fù)合維生素對AD進(jìn)行早期預(yù)防和干預(yù)，對提高機(jī)體抗氧化能力,減輕氧化應(yīng)激對腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷,改善認(rèn)知功能,預(yù)防AD的發(fā)生,延緩病情的進(jìn)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

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Relationship of the levels of 5 kinds of vitamin in serum with Alzheimer’s disease

ZHUJin-feng,DANGRui,CUIYu,WANGChao,XIEWei,WANGDe-cai.PublicHealthCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China

Objective To investigate the levels of vitamin A, D3, B1, B2and B12in the serum of patients with Alzheimer’s disease (AD), and to investigate the correlation with AD. Methods A cross-sectional case control study was conducted. Methanol, hexane extraction, nitrogen concentration and ethanol volume were utilized in Vitamin A, D3for the pretreatment of samples. Vitamin B1, B2, B12were extracted with C18 column, and the volume was controlled with methanol/water (80%). The determination was performed by high performance liquid chromatography with ultraviolet detector (HPLC-UVD). Results The levels of vitamin A, D3, B1, B2, B12in the patients with AD were significantly lower than those in healthy controls (P< 0.05). Conclusions The occurrence and prognosis of AD are closely related with the levels of vitamin A, D3, B1, B2, B12. Nutritional intervention might be helpful for the prevention and treatment of AD.

vitamin; Alzheimer’s disease; high performance liquid chromatography

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273193)

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室

王德才，Email：decaiwang@live.cn

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.012

2014-08-29)