海洋微生物在船舶用結(jié)構(gòu)鋼表面附著成膜過程及其腐蝕研究

董耀華，賀中意，郭 娜，劉 濤，董麗華

(上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

海洋微生物在船舶用結(jié)構(gòu)鋼表面附著成膜過程及其腐蝕研究

董耀華，賀中意，郭 娜，劉 濤，董麗華*

(上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

通過紫外分光光度計測定了海洋微生物需鈉弧菌Vibrionatriegens的生長曲線，通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測了該細菌在船舶用結(jié)構(gòu)鋼(DH32)鋼樣表面成膜過程及試樣腐蝕形貌，探討了生物膜的形成過程及其對材料表面腐蝕的影響。結(jié)果表明，生物膜的形成過程與微生物生命活動關(guān)系密切。根據(jù)對比暴露在菌液和無菌培養(yǎng)基中的試樣表面形貌，發(fā)現(xiàn)細菌的附著及成膜過程的不均勻性，改變了DH32鋼樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)。細菌附著區(qū)與周圍形成的氧濃差電池，以及細菌新陳代謝主要產(chǎn)物對金屬離子的絡(luò)合，共同促進了試樣局部腐蝕加速。

海洋微生物；生物膜；腐蝕

0 引言

海洋船舶用結(jié)構(gòu)鋼作為最常見的涉海材料之一，主要包括高強鋼AH32、DH32、AH36和DH36等，厚度在12～30 mm之間，這類船舶用鋼強度高，但耐海洋環(huán)境生物腐蝕的性能卻比較差。海洋微生物活性所引起的微生物腐蝕(microbially-influenced corrosion, MIC)已經(jīng)被公認為是船舶及海洋工程用結(jié)構(gòu)鋼腐蝕破壞的重要形式[1-3]。在海洋環(huán)境中服役的船舶，由海洋污損導(dǎo)致的燃油消耗增加可達40%，航次總成本增加可達77%，而且每年僅用于全球船只防污劑美觀工藝的花費約有7億美元，此外更為嚴重的是，船舶海水冷卻管道和諸如船舶壓載艙等各種液體艙的微生物腐蝕破壞也極大地影響船舶壽命及安全性[4-5]。

大量的實驗表明，在海洋環(huán)境中，與金屬直接接觸的腐蝕介質(zhì)并非海水而是微生物，所以可以肯定船舶用鋼腐蝕破壞的重要發(fā)生因素是微生物通過在材料表面附著及形成的生物膜與其發(fā)生相互作用，使得材料表面始終處于非穩(wěn)定狀態(tài)，直接或間接參與和影響了金屬的腐蝕過程[6]，從而導(dǎo)致金屬性能的劣化和破壞。MIC是一個相當(dāng)復(fù)雜的生物和化學(xué)過程，目前有關(guān)MIC的研究層出不窮，例如REMAZEILLES et al[7]認為，微生物膜對陰極反應(yīng)動力學(xué)的影響可能導(dǎo)致腐蝕電位的正移，同時微生物膜內(nèi)形成的氧濃差電池和陰極反應(yīng)速度的增加使得天然海水比無菌海水更具腐蝕性。JAVAHERDASHTI et al[8]認為，金屬表面的酸化和微生物膜內(nèi)的過氧化氫的產(chǎn)生是導(dǎo)致材料腐蝕電位正移的原因。BEECH[9]研究了腐化海水環(huán)境中碳鋼的腐蝕行為，提出微生物膜內(nèi)硫酸鹽還原菌(SRB)的存在是加速材料腐蝕的主要原因，他認為SRB釋放的硫化氫導(dǎo)致膜內(nèi)pH值下降，加速了陽極溶解。OSIRO et al[10]也證實了相關(guān)的結(jié)論，同時提出微生物膜內(nèi)特殊酶的作用也是影響材料腐蝕行為的主要因素之一。趙軍 等[11]卻認為微生物胞外分泌物(EPS)是影響材料腐蝕行為的主要原因。此外，也有大量學(xué)者認為微生物膜的形成可以阻礙溶解氧的擴散或分泌某種具有緩蝕作用的物質(zhì)，從而抑制材料腐蝕，起到保護材料的作用[12-15]。由此可見，目前大部分研究主要著眼于生物膜對金屬腐蝕的影響及機制，很少去分析生物膜形成的過程，而事實上，微生物的附著過程對船舶用鋼的耐海洋微生物腐蝕研究卻至關(guān)重要[7]。本文以DH32鋼為研究對象，以海洋環(huán)境中普遍存在的需鈉弧菌Vibrionatriegens為實驗菌種，使用紫外分光光度計(UV-Vis，PerkinElmer，Lambda35)、電子掃面顯微鏡(SEM，JEOL，JSM7500F)和原子力顯微鏡(AFM，Bruke，Dimension ICON)等測定了V.natriegens的生長曲線，探討了其在DH32鋼樣表面的附著過程以及對試樣腐蝕行為的影響。

1 實驗方法

1.1 材料和試樣

實驗材料為碳鋼DH32，其主要合金成分為：Fe 96.79%，C 0.056%，Mn 1.496%，Cu 0.198%， Al 0.037 5%，Ni 0.662%，Cr 0.183%，Si 0.191%和P 0.008 5%。實驗前，將DH32鋼板用線切割機切成一批尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的鋼樣，將其任意10 mm×10 mm的一面選擇為工作面，非工作面用焊接導(dǎo)線，并用環(huán)氧樹脂封裝，工作面并經(jīng)300#、600#、800#和1 200# 耐水SiC砂紙依此打磨，然后用0.3 μm氧化鋁粉末進行拋光處理，丙酮超聲除油，最后用乙醇沖洗、自然干燥待用。

1.2 細菌培養(yǎng)及生長曲線測定

需鈉弧菌采用淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其成分為：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L和可溶性淀粉2 g/L。

生長曲線通過比濁法測定。具體步驟如下：用移液槍吸取0.01 mL過夜V.natriegens菌液，加入到100 mL無菌培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分為：1 L 過濾后的無菌海水、10 mg/L FePO4、5 g/L蛋白胨和1 g/L 酵母汁)，然后放置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照實驗預(yù)設(shè)時間，每次取出0.5 mL與4.5 mL無菌培養(yǎng)基混合均勻后用紫外-可見分光光度計(UV-Vis，Lambda 35)測定在600 nm下的O.D600 nm值。實驗做3個平行樣，結(jié)果取3次測量的平均值。

1.3 微生物在金屬表面附著成膜過程觀測

將準備好的DH32試樣依此用尼龍繩懸掛放入新培養(yǎng)的需鈉弧菌培養(yǎng)液中，每7 d更換一半的培養(yǎng)基。按照實驗預(yù)設(shè)時間間隔依此將試樣取出，并用PBS緩沖液緩慢沖洗工作表面，然后將試樣置于100 mL含2%戊二醛的PBS溶液中固化5～8 h，取出后，依此用體積分數(shù)分別為25%，50%，75%和100%的乙醇逐級脫水，然后低溫干燥[8]。利用SEM(Japan, JEOL , JSM7500)在5.0 kV工作電壓下對其表面進行掃描電鏡觀察，同時采用能譜儀(EDS)進行材料表面元素種類分析及含量測定。

1.4 材料表面腐蝕微觀形貌

刮取試樣表面的生物膜和腐蝕產(chǎn)物，乙醇逐級脫水，低溫干燥后，再次使用原子力顯微鏡(AFM，Dimension ICON)在輕敲模式下作表面觀察。實驗以無菌培養(yǎng)基作對照，試樣處理方法與有菌培養(yǎng)基處理方法相同。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 細菌生長曲線

根據(jù)比濁法，使用紫外-可見分光光度計測定菌液透光度，再據(jù)其與菌液中細菌數(shù)量之間的線性關(guān)系，得到細菌的生長曲線，如圖1所示。

圖1 需鈉弧菌的生長曲線

從實驗結(jié)果來看，V.natriegens的生長過程大致可以分為4個階段：最初的1個階段為生長延滯期，出現(xiàn)在需鈉弧菌擴培的第1天，這段時間由于培養(yǎng)基成分和生長環(huán)境的變化等因素，影響了需鈉弧菌生長，具體表現(xiàn)為盡管需鈉弧菌形態(tài)開始變大或增長，細胞合成代謝十分活躍，核糖體和酶類等合成加速，胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量也在增高，原生質(zhì)呈嗜堿性，變得均勻，但需鈉弧菌暫時停滯生長，數(shù)量增長速率常數(shù)為零。第2個階段為生長指數(shù)期，或者稱生長對數(shù)期，出現(xiàn)在擴陪的第2天至第3天，這段時間里，需鈉弧菌代謝旺盛，酶系活躍，細菌數(shù)量以幾何級數(shù)快速增長，并在3 d后達到最大值。第3個階段為穩(wěn)定期，出現(xiàn)在生長指數(shù)期的隨后1 d左右時間內(nèi)，特點是需鈉弧菌數(shù)量大致恒定，即處于新繁殖的細胞數(shù)量與衰亡的細胞數(shù)量相等的動態(tài)平衡中，這時的需鈉弧菌產(chǎn)量達到了制高點，菌體的產(chǎn)量與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗呈現(xiàn)規(guī)律比例關(guān)系。從第5天開始，需鈉弧菌進入第4個階段，即衰亡期，此時，外界環(huán)境對需鈉弧菌生長越來越不利，細胞形態(tài)相繼發(fā)生變化，甚至因蛋白水解酶活力的增加而發(fā)生自溶現(xiàn)象，細菌大量死亡，個體死亡速率超過新生速度，培養(yǎng)基中呈現(xiàn)細菌負生長狀態(tài)。

2.2 微生物在金屬表面附著成膜過程分析

需鈉弧菌是一種在海洋環(huán)境普遍存在的固氮類細菌，并且是世界上繁殖速度最快的細菌之一，極易在材料表面形成生物膜[3]。圖2是DH32試樣懸掛于需鈉弧菌的培養(yǎng)基中不同時期的表面細菌附著形貌SEM照片。從圖中可以看出，試樣浸泡1 d后，原本光滑的表面上附著了一些零星的細菌個體和少量的腐蝕產(chǎn)物；浸泡3 d后，試樣表面開始形成分布不均的菌落，細菌顯著變多，并呈鏈狀排列；浸泡5 d后，可以觀察到明顯的細菌新陳代謝產(chǎn)物，即EPS。之后，隨著時間的推移，試樣表面附著的細菌越來越多，菌落也逐漸變大，試樣可見面積越來越小，42 d后，試樣表面被一層致密的微生物膜完全覆蓋。

結(jié)合需鈉弧菌生長曲線的測定結(jié)果可知，在試樣浸泡初期，細菌處于生長延滯期，培養(yǎng)基中細菌數(shù)量不多，所以只有零星的細菌以個體形式附著在試樣表面，而這種附著過程，可能是因為試樣放入培養(yǎng)基后，表面會吸附一些溶解態(tài)的有機物或無機物，改變了材料表面的電荷電性或憎水性等特征，使得具有類似膠體表面的細菌被吸附到了材料表面。之后隨著對環(huán)境的適應(yīng)，細菌進入生長指數(shù)期，開始大量繁殖，吸附在試樣表面的細菌也開始形成菌落，胞外分泌物開始變多。這種分泌物可以部分解釋細菌黏附到材料表面的原因，因為它可以幫助微生物緊緊地吸附在材料的表面。在接下來的時間里，材料表面的菌落越來越多，這一方面是由于細菌的附著使得材料表面狀態(tài)發(fā)生了改變，細菌的附著變得越來越容易，另一方面是已經(jīng)附著的細菌也在材料表面繼續(xù)繁殖，這個過程中，生物膜逐漸形成，而且越來越厚，里面不僅僅是活的細菌，還包括它們新陳代謝的產(chǎn)物和衰亡的細菌，這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得材料與微生物之間形成了一種半生命、半活性的特殊復(fù)合界面結(jié)構(gòu)。

圖2 DH32試樣在菌液中浸泡不同時間后表面細菌 附著的SEM形貌

圖3是DH32試樣在菌液中浸泡不同時間后，表面的EDS譜圖。由圖可見，浸泡1 d后，試樣表面的主要化學(xué)元素為Fe、C、Mn和少量的P(圖3a)。浸泡7 d后(圖3b)，試樣表面檢測出O、N和Na等元素，而且P和C元素含量成倍增長。21 d后(圖3c)，P和O元素含量持續(xù)增長，而且檢測出S元素的存在。此外，從檢測結(jié)果看來，F(xiàn)e元素含量隨時間推移持續(xù)減少。

圖3 試樣在菌液中浸泡1 d(a)、7 d(b)和 21 d(c)后表面EDS能譜圖

元素Fe、C和Mn是DH32冶煉中的主要成分，元素P、O、N和S是微生物生命活動必不可少的生命元素。第1天少量P元素的出現(xiàn)，說明試樣表面有少量細菌附著，但因沒有檢測出O元素，所以可以判斷，此時試樣幾乎沒有受到培養(yǎng)基和細菌的影響，這與SEM觀察到的結(jié)果基本一致。隨后的20 d內(nèi)，N和S元素依次出現(xiàn)，P和O元素持續(xù)增多，這些生命元素的變化，說明材料表面的生物膜逐漸形成，同時從Fe元素含量逐漸降低的趨勢來看，微生物膜隨時間推移越來越致密，使得試樣表面的Fe元素越來越難被檢測到。

2.3 表面腐蝕微觀形貌

為了直觀地了解微生物附著過程對材料腐蝕的影響，使用無菌培養(yǎng)基浸泡試樣作為對照，比較兩種情況下，試樣的腐蝕程度。圖4a和圖4c分別為試樣暴露在菌液中3 d和42 d后的表面AFM腐蝕形貌圖，圖4b和圖4d為試樣暴露在無菌海水中3 d和42 d后的表面AFM腐蝕形貌圖。從圖中可以看出，前3 d內(nèi)，浸泡在兩種腐蝕介質(zhì)中的試樣表面粗糙度較小，且沒有顯著區(qū)別，這說明浸泡初期，細菌生長延滯，新陳代謝活性不高，試樣表面附著的細菌也不多，試樣的腐蝕以海水腐蝕為主，細菌對試樣腐蝕行為的影響不大。但在隨后的觀察中可以發(fā)現(xiàn)，浸泡在菌液中42 d后的試樣，其表面粗糙不堪，其局部腐蝕程度明顯大于對照樣。這說明，微生物的附著和繁殖過程，改變了試樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)，影響了材料腐蝕行為，并在局部起到劇烈加速材料腐蝕的作用。

由于需鈉弧菌是一種需氧細菌，其新陳代謝活動需要消耗氧氣[3]。在需鈉弧菌附著的過程中，菌落的形成和分布并不均勻，所以其局部的耗氧活動無疑會導(dǎo)致試樣表面細菌附著區(qū)局部溶解氧的降低，而周圍區(qū)域氧含量較高，進而造成試樣表面富氧區(qū)和貧氧區(qū)的分化，使局部形成氧濃差電池，貧氧區(qū)形成陽極，周圍成為陰極，從而加速材料局部腐蝕。盡管部分研究者認為微生物的生命活動可以改變環(huán)境pH值，進而影響材料腐蝕行為[16]，但從圖4c中明顯的不均勻腐蝕形貌來看，氧氣濃度的變化對金屬腐蝕的影響要大于pH值變化的影響，氧氣對陰極的去極化作用可以使材料加速腐蝕。造成試樣在微生物附著成膜過程中加速腐蝕的另外一個原因可能也和細菌新陳代謝產(chǎn)物EPS有關(guān)。EPS主要由蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂類等高分子物質(zhì)組成，其中含有大量的諸如羥基、羧基、磷酸根、硫酸根、甘油酸根、丙酮酸根和琥珀酸根等帶負電的官能團[17-18]。這些官能團有一個重要的特點，即能與帶正電荷的金屬離子，如Fe3+、Mn2+和Cu2+等結(jié)合發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而作為電子運輸器，在微生物膜和金屬基體之間開啟新的氧化還原反應(yīng)途徑，導(dǎo)致電子從基體向受體的轉(zhuǎn)移，促進試樣陽極溶解，加速材料腐蝕。

圖4 試樣浸泡在菌液(a、c)和無菌培養(yǎng)基(b、d)中不同時間后的AFM圖

3 結(jié)論

本文通過紫外分光光度計測定了海洋微生物需鈉弧菌的生長曲線，通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測了該細菌在船舶用結(jié)構(gòu)鋼(DH32)鋼樣表面成膜過程及試樣腐蝕形貌，結(jié)果表明生物膜的形成與微生物生命活動關(guān)系密切。在生長初期，細菌新陳代謝活性不高，試樣表面附著的細菌也不多，試樣的腐蝕以海水腐蝕為主，細菌對試樣腐蝕行為的影響不大。但隨時間推移,細菌大量繁殖，在試樣表面形成分布不均的大小菌落，并逐漸形成一層致密的生物膜。在微生物膜的形成過程中，因為菌落分布不均以及細菌新陳代謝產(chǎn)物EPS對材料表面金屬離子的絡(luò)合，改變了試樣表面的物理和化學(xué)狀態(tài)，影響了材料腐蝕行為，并加速了材料的局部腐蝕速度。

[1] WANG Qing-fei，SONG Shi-zhe. Progress in marine biological influenced corrosion study[J]. Journal of Chinese Society for Corrosion and Protection,2002,22(3):184-188. 王慶飛,宋詩哲.金屬材料海洋環(huán)境生物污損腐蝕研究進展[J].中國腐蝕與防護學(xué)報.2002,22(3):184-188.

[2] NATARAJAN K A.Biofouling and microbially influenced corrosion of stainless steels[J]. Century of Stainless Steels,2013,28(125):2 536-2 547.

[3] DONG Ze-hua, LIU Tao, LIU Hong-fang. Influence of EPS isolated from thermophilic sulphate-reducing bacteria on carbon steel corrosion[J]. Biofouling,2011,27(5):487-495.

[4] NIU Gui-hua. Electrochemical corrosion behavior of 316 stainless steel in marine microbial medium[J]. Chemical Research,2008,19(3):83-90. 牛桂華.海洋微生物對316不銹鋼的電化學(xué)腐蝕行為[J].化學(xué)研究,2008，19(3)：83-90.

[5] FUSHIMI K，YANAGISAWA K，NAKANISHI T，et al. Microelectrochemistry of dual-phase steel corroding in 0.1 M sulfuric acid[J]. Electrochim Acta,2013,114:83-87.

[6] MELCHERS R E. Microbiological and abiotic processes in modelling longer-term marine corrosion of steel[J]. Bioelectrochemistry，2014,97(S1)：89-96.

[7] REMAZEILLES C， SAHEB M，NEFF D，et al. Microbiologically influenced corrosion of archaeological artefacts: characterisation of iron(II) sulfides by Raman spectroscopy[J]. J Raman Spectrosc,2010,41(25):1 425-1 433.

[8] JAVAHERDASHTI R, RAMAN R K S，PANTER C. Microbiologically assisted stress corrosion cracking of carbon steel in mixed and pure cultures of sulfate reducing bacteria[J]. Int Biodeterior Biodegrad,2006,58(01):27-35.

[9] BEECH I B．Corrosion of technical materials in the presence of biofilms-current understanding and state of the art methods of study[J]．International Biodeterioration & Biodegradation，2004，53(3)：177-183.

[10] OSIRO D, COLNAGO L A, OTOBONI A M, et al. A kinetic model forXylellafastidiosaadhesion, biofilm formation, and virulence[J]. FEMS Microbiology Letters,2004,236(2):313-318.

[11] ZHAO Jun, XU Gao-tian, QIN Zhe, et al. Composing of extracellular polymeric substances and its effect on sludge characteristics[J]. Safety and Environmental Engineering,2008,15(1):66-73. 趙軍，徐高田，秦哲，等.胞外聚合物EPS組成及對污泥特性的影響研究[J].安全與環(huán)境工程,2008,15(1)：66-73.

[12] MANSFELD F. The interaction of bacteria and metal surfaces [J]. Electrochimica Acta,2007,52(27):7 670-7 680.

[13] BEECH I B，SUNNER J. Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals[J]. Current Opinion in Biotechnology,2004，15(3):181-186.

[14] BORENSTEIN S W. Microbiologically influenced corrosion handbook[M]. Cambridge, U.K: Woodhead Publishing,1994:310.

[15] CHANG E T，EARTHMAN J C. Axenic aerobic biofilms inhibit corrosion of SAE 1018 steel through oxygen depletion [J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,1997,48(1):11-17.

[16] GONZDLEZ J E G，SANRANA F J H，MIRZA J C．Effect of bacterial biofilm on 316ss corrosion in natural seawater by EIS[J]．Corrosion Science，1998，40(12)：2 141-2 154．

[17]DONG Yao-hua, LIU Tao, SUN Shi-bin, et al. Preparation and characterization of SiO2/polydopamine/Ag nanocomposites with long-term antibacterial activity[J]. Ceramics International,2014,40(4):5 605-5 609.

[18] PIERSON J A. Real-time monitoring and control of sequencing batch reactors for secondary treatment of a poultry processing wastewater[J]．Water Environment Research，2000，72(5)：585-592.

The formation process of biofilm of marine microorganism and the influence on the corrosion of the ship structural steel

DONG Yao-hua， HE Zhong-yi， GUO Na， LIU Tao， DONG Li-hua*

(TheInstituteforMarineMaterialsScienceandEngineering，ShanghaiMaritimeUniversity，Shanghai201306，China)

In order to study the influence of the formation of biofilm on the corrosion of DH32 structural steel, the growth curve of a marine microorganism (Vibrionatriegens) was tested by UV-Vis spectra, the formation process of biofilm and the surface of the coupons were characterized by scanning electron microscope and atomic force microscope, respectively. The results show that the formation of biofilm closely associates with the growth of bacteria, the formation process of biofilm changes the chemical and physical state of the steel surface. Moreover, the formation of oxygen concentration cell and binding power of extracellular polymeric substances with metal ions greatly promotes the DH32 surface oxidation corrosion.

marine microorganism; biofilm; corrosion

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006.

2014-10-24

2014-12-10

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助(2014CB643306)；上海自然科學(xué)基金項目資助(14ZR1419800)

董耀華(1983-)，男，湖北潛江市人，博士，講師，主要從事海洋與船舶工程方面的研究。E-mail：yhdong@shmtu.edu.cn

*通訊作者:董麗華(1964-)，女,教授，主要從事海洋與船舶工程方面的研究。E-mail：lhdong@shmtu.edu.cn

X17

A

1001-909X(2015)01-0039-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006

董耀華，賀中意，郭娜，等.海洋微生物在船舶用結(jié)構(gòu)鋼表面附著成膜過程及其腐蝕研究[J].海洋學(xué)研究,2015,33(1):39-44,

DONG Yao-hua，HE Zhong-yi，GUO Na, et al. The formation process of biofilm of marine microorganism and the influence on the corrosion of the ship structural steel[J]. Journal of Marine Sciences,2015,33(1):39-44, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.01.006.