細葉百合冷藏過程中鱗莖保護酶活性與休眠解除的關系

劉芳，李丹丹，廉華，吳瑕，陳業(yè)雯，李雨琦，謝守峰，陳學武

(黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，黑龍江 大慶163319)

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細葉百合冷藏過程中鱗莖保護酶活性與休眠解除的關系

劉芳*，李丹丹，廉華，吳瑕，陳業(yè)雯，李雨琦，謝守峰，陳學武

(黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，黑龍江 大慶163319)

以細葉百合為試材，通過冷藏(5℃)解除鱗莖休眠，研究了細葉百合鱗莖解除休眠過程中鱗莖保護酶活性與糖代謝的變化規(guī)律。結(jié)果表明，鱗片、頂芽及鱗莖盤SOD活性在冷藏0～24 d內(nèi)下降，除頂芽外，鱗莖各部位POD活性在0～24 d內(nèi)呈下降趨勢，外鱗片、頂芽及鱗莖盤中CAT活性在冷藏0～12 d內(nèi)下降，冷藏中后期，SOD、CAT、ASP 活性升高，鱗片中POD的活性下降，頂芽及鱗莖盤POD、PPO在冷藏中期上升。各種代謝相關酶在不同器官中的作用并不完全相同。在低溫處理36～60 d內(nèi)，ASP、CAT活性快速上升，后期趨于穩(wěn)定。SOD活性最低點出現(xiàn)在冷藏36～60 d，鱗莖各部位淀粉與CAT、PPO、ASP均表現(xiàn)為負相關性，SOD、POD、PAL與鱗片中淀粉表現(xiàn)為正相關性。36 d是鱗莖解除休眠的起點，60 d時鱗莖基本解除休眠。

細葉百合；鱗莖；休眠；冷藏；保護酶

細葉百合屬草本花卉，在園林和草地建設中應用很廣，觀賞性強，又兼有藥用和食用的價值。秋季鱗莖收獲后即進入休眠狀態(tài)。休眠期間，鱗莖外部形態(tài)變化不明顯，但其內(nèi)部仍發(fā)生著非常復雜的生理生化反應。鱗莖休眠解除過程中淀粉與可溶性糖之間的轉(zhuǎn)化是提供能源的重要代謝途徑[1-2]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶類作為保護酶在百合鱗莖休眠解除過程中也具有重要的作用。喬永旭等[3]在研究4℃低溫處理過程中東方百合鱗莖的抗氧化系統(tǒng)酶的動態(tài)變化中指出，SOD呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。CAT的活性在低溫處理前期下降，隨后又上升，45 d后又迅速下降，與過氧化氫的動態(tài)變化趨勢一致。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,ASP)和POD的活性在低溫解除休眠過程中都呈先上升后下降的趨勢。孫紅梅等[4]提出低溫解除休眠的鱗莖內(nèi)酚類物質(zhì)的含量增加可能對蘭州百合鱗莖的萌發(fā)起促進作用。而苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是形成酚類物質(zhì)的關鍵酶，其研究表明，隨著貯藏期的延長，鱗莖盤的 PAL 活性下降，頂芽與鱗片的 PAL 活性有增加趨勢。有研究表明，亞洲百合低溫破眠期內(nèi)PAL活性下降，PPO活性增加[5]?？梢姡蜏靥幚硪鸬幕钚匝醴e累及抗氧化酶類的代謝變化可能是百合鱗莖低溫破眠的誘因。

糖類化合物含量及鱗莖保護酶的代謝規(guī)律因百合種類的不同而存在差異，國內(nèi)外對百合鱗莖在低溫處理過程中鱗莖內(nèi)抗氧化酶類活性及活性氧含量變化的研究也比較少。3～5℃處理對大多數(shù)百合解除休眠均有較好的效果[6]，本試驗前期已從細葉百合鱗莖外部形態(tài)和生物量的變化及鱗莖內(nèi)部細胞組織超微結(jié)構方面進行了系統(tǒng)的研究，已經(jīng)明確鱗莖休眠解除的時間進程，鱗莖冷藏36～72 d內(nèi)，細胞生物膜系統(tǒng)逐漸活躍，胞內(nèi)及胞間聯(lián)系逐漸建立，鱗莖冷藏84 d時已經(jīng)出芽，休眠徹底打破[7]。因此，本研究試圖從5℃低溫誘導細葉百合休眠解除過程中鱗莖保護酶活性的變化規(guī)律入手，利用相關分析對重要糖類化合物和鱗莖保護酶之間的相關性進行系統(tǒng)的研究。旨在闡明低溫處理所誘導的百合鱗莖的適應性與抗氧化酶類之間的關系，以及抗氧化酶對鱗莖休眠解除的作用。為全面了解百合鱗莖休眠的生理生化調(diào)控機制提供參考信息。

1 材料與方法

供試材料為從凌源引種的野生種細葉百合，鱗莖周徑4～6 cm。

于2012年10月中旬采收細葉百合休眠鱗莖于5℃冰箱中冷藏處理，冷藏基質(zhì)為蒸汽消毒的潮濕珍珠巖。低溫處理階段，每12 d取樣1次，每次隨機取10個鱗莖，分成外層、內(nèi)層鱗片、頂芽、鱗莖盤四部分，測定其生理指標。每處理3次重復。

淀粉和可溶性糖含量的測定，采用蒽酮比色法[8]。SOD活性測定參照高俊鳳[9]的方法。 CAT活性測定，采用紫外分光光度法[10]。ASP活性測定參照沈文飚等[11]的方法。POD活性測定，采用愈創(chuàng)木酚法[5]。PPO活性測定，采用兒茶酚法[5]。PAL活性測定，采用巰基乙醇法[5]。試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行計算和處理，利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1百合鱗莖冷藏過程中糖類化合物含量的變化

糖類化合物的代謝在百合鱗莖低溫貯藏過程中起著重要的作用。由表1可知，內(nèi)外層鱗片淀粉含量遠遠高于鱗莖盤和頂芽，冷藏過程中，內(nèi)外層鱗片淀粉含量隨冷藏時間的延長呈逐漸下降的趨勢。0～36 d內(nèi)下降較快。頂芽在整個貯藏過程中淀粉含量先下降再上升再下降，在冷藏48 d時含量最高，84 d時淀粉含量最低。鱗莖盤淀粉含量的變化呈先上升后下降的拋物線變化趨勢，在冷藏24 d時淀粉含量升至峰值，此后淀粉含量逐漸下降，84 d時含量最低?？傮w來看，在冷藏期內(nèi)百合鱗莖各部位的可溶性糖含量均呈上升趨勢。外層鱗片可溶性糖含量48 d后有所下降，在冷藏84 d時又出現(xiàn)回升現(xiàn)象。內(nèi)層鱗片在冷藏60 d時可溶性糖含量達到峰值。鱗莖冷藏48～60 d是鱗片可溶性糖發(fā)生變化的轉(zhuǎn)折點。鱗莖盤和頂芽中淀粉在冷藏各時期差異不顯著，鱗片中淀粉及鱗莖各部位可溶性糖含量在冷藏0，36，60，84 d均有顯著差異。

表1 百合鱗莖冷藏過程中糖含量的變化Table 1 The changes of sugar content of L.pumilum bulbs during cold storage

注：同列不同小寫字母代表0.05 水平上差異顯著，下同。

Note：Different lowercase letters within the same column for the same organ mean significant differences at 0.05 level，the same below．

2.2細葉百合鱗莖冷藏過程中保護酶活性的變化

從表2可以看出，內(nèi)外鱗片中的SOD活性在冷藏0 d時高于頂芽和鱗莖盤。整體來看，鱗莖各部位SOD活性出現(xiàn)了先降低后上升的趨勢。冷藏初期SOD下降幅度比較大，鱗片在冷藏48 d降至最低值之后逐漸回升。頂芽SOD活性在各個時期均比鱗莖盤高，36 d之后逐漸回升。

鱗片內(nèi)CAT活性較低，0～60 d內(nèi)CAT活性變化不大，60 d后緩慢升高。頂芽及鱗莖盤在冷藏初期略有下降，冷藏12 d后逐漸升高，在24～72 d內(nèi)變化幅度最大，整個冷藏期間，頂芽各個取樣時期CAT活性都比鱗莖盤高，頂芽及鱗莖盤CAT活性都明顯高于內(nèi)外層鱗片。鱗莖各部位CAT的活性在冷藏后期保持平穩(wěn)。鱗莖中SOD及CAT活性在貯藏前期、中期和后期有顯著差異。

內(nèi)層鱗片在冷藏過程中活性逐漸降低。外層鱗片冷藏至48 d后迅速下降，POD活性在冷藏72 d時最低，84 d時活性升高。頂芽在冷藏初期，POD 活性整體呈上升趨勢，鱗莖盤POD 活性隨貯藏時間的延長呈先降低后升高的趨勢，冷藏處理初期下降，冷藏24 d時活性最低。低溫處理過程中，頂芽和鱗莖盤POD 活性遠遠高于內(nèi)外層鱗片。60～84 d酶活性基本上趨于穩(wěn)定狀態(tài)。鱗莖中POD活性變化在各時期差異不明顯。

鱗莖不同部位ASP的活性在低溫冷藏過程中整體上表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，低溫處理初期無明顯變化，內(nèi)外層鱗片在24～60 d內(nèi)活性迅速增加，外層鱗片48 d達最大值，之后緩慢降低，內(nèi)層鱗片60 d達到最大值，60 d后趨于平緩。頂芽及鱗莖盤12 d內(nèi)無明顯變化，之后ASP的活性逐漸升高，36 d頂芽活性最高，48 d下降幅度較大，48～84 d又逐漸上升，每個時期的變化幅度不大。鱗莖盤在冷藏12～84 d緩慢上升，60 d達到峰值。冷藏0和36 d的鱗莖ASP活性差異比較顯著。

從不同貯藏時間看，百合鱗莖冷藏過程中，內(nèi)外層鱗片和鱗莖盤PPO的活性表現(xiàn)為增強的趨勢。內(nèi)外鱗片PPO的活性在24～84 d內(nèi)變化幅度較大，0，36，60 d時PPO活性差異都很顯著，48 d外層鱗片活性達到高點后基本保持平穩(wěn)，內(nèi)層鱗片在24～84 d內(nèi)持續(xù)增加。鱗莖盤和頂芽PPO的活性在冷藏初期維持較低水平，冷藏中期有下降趨勢，36 d后逐漸上升，鱗莖盤在72 d活性最高，頂芽在整個冷藏期PPO的活性變化范圍不大。

鱗莖冷藏期PAL活性也發(fā)生了一定的變化?？傮w來看，內(nèi)外層鱗片、頂芽和鱗莖盤的 PAL 活性隨貯藏時間的延長而降低，鱗莖盤的 PAL 活性明顯高于鱗莖其他部位，鱗莖盤24 d內(nèi)PAL活性迅速下降至最低值，之后逐漸回升，0，36，60 d時PAL活性差異顯著，60～84 d活性變化不大，趨于穩(wěn)定。內(nèi)外層鱗片、頂芽的活性水平差異不大。頂芽與內(nèi)部鱗片PAL 活性在貯藏初期的36 d內(nèi)變化幅度最大，36 d降至最低點，貯藏中后期又呈逐漸上升趨勢，貯藏末期略有下降。外層鱗片除在貯藏12 d時有小幅度增加外，整個冷藏過程中逐漸下降。

表2 百合鱗莖冷藏過程中保護酶活性的變化Table 2 Changes of protective enzymes activity of L.pumilum bulbs during cold storage

2.3細葉百合鱗莖冷藏過程中碳水化合物與鱗莖保護酶的相關性分析

從碳水化合物與鱗莖保護酶的相關性數(shù)據(jù)中分析可知(表3)，鱗莖不同部位淀粉、可溶性糖與6種保護酶活性的相關性是不同的，外層鱗片與內(nèi)層鱗片中各個指標的相關性是一致的，其相關系數(shù)和顯著性水平不同。鱗莖各部位淀粉與CAT、PPO、ASP均表現(xiàn)負相關性，SOD、POD、PAL與鱗片中淀粉表現(xiàn)為相關系數(shù)較高的正相關性。頂芽及鱗莖盤中淀粉與POD、PAL相關性表現(xiàn)一致，淀粉與SOD相關性則相反。鱗片中可溶性糖與SOD、PPO、ASP 相關性都達到了顯著水平，頂芽及鱗莖盤中可溶性糖與CAT活性表現(xiàn)為極顯著正相關。各種保護酶在百合鱗莖不同部位的相關關系差異很大，SOD與CAT在鱗莖各部位中均表現(xiàn)為負相關，頂芽中相關系數(shù)達到了極顯著水平，其他部位相關系數(shù)較低。SOD與ASP、CAT與PAL、PAL與ASP在鱗莖不同部位中均表現(xiàn)為負相關性，相關性水平各有差異。SOD與PAL、CAT與 ASP在鱗莖不同部位中均表現(xiàn)為正相關，總體來看，這4種酶類所表現(xiàn)的正相關系數(shù)都不是很高。

表3 鱗莖中碳水化合物與保護酶的相關分析Table 3 Correlation analysis of carbohydrates and protective enzymes in bulbs

**和*分別表示0.01和0.05水平的相關性。

**and*indicate the significance ofP<0.01 andP<0.05 respectively.

3 討論

酶活性的變化是影響植物體一切生理生化反應變化的重要因素，它是細胞代謝的原動力之一。百合休眠鱗莖在整個低溫貯藏期，從休眠的逐漸破除到芽的萌發(fā)生長，整個過程中不斷伴隨著一系列的物質(zhì)分解和合成代謝，期間鱗莖內(nèi)相關的酶也發(fā)生了復雜的變化。

鱗片、頂芽及鱗莖盤SOD、POD、CAT活性在冷藏前期都有下降趨勢，低溫貯藏中后期，SOD、CAT、ASP活性均升高，頂芽及鱗莖盤POD在冷藏中期也呈上升趨勢，3種酶活性的增加可能是因為低溫處理誘導鱗莖產(chǎn)生了高水平的活性氧，因此刺激了抗氧化酶活性的提高，SOD能夠催化超氧化物分解生成H2O2，以此保護細胞免受氧自由基的破壞和氧化損傷。本試驗中，SOD活性在冷藏前期下降可能是因為分解O2-·產(chǎn)生的H2O2在鱗莖內(nèi)積累沒有及時被降解而出現(xiàn)的反饋抑制作用，隨著低溫的積累以及各種抗氧化酶活性的增加，H2O2被分解，SOD的活性又升高。喬永旭等[3]的研究表明，東方百合“索蚌”在4℃低溫處理過程中鱗莖中O2-·的釋放速率在冷藏前期緩慢上升，30 d時達到最大值，以后迅速下降。H2O2含量在低溫冷藏15～45 d內(nèi)逐漸升高，45 d后隨低溫積累含量迅速下降。其測定的SOD活性變化與本試驗的研究也是一致的，可見SOD活性與鱗莖內(nèi)H2O2的含量變化密切相關。高東升等[12]認為H2O2含量的提高促進了植物休眠的解除，H2O2可能作為一種信號物質(zhì)通過改變鱗莖的代謝途徑進而促進鱗莖打破休眠狀態(tài)。邵浩和馬鋒旺[13]認為花芽細胞內(nèi)活性氧代謝影響著植物休眠解除的進程。已有研究表明在植物打破休眠時有多種與活性氧產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導相關的基因表達[14-15]，H2O2含量的升高有活化戊糖磷酸途徑的功能，使呼吸代謝由糖酵解途徑轉(zhuǎn)向戊糖磷酸途徑[16]。POD和CAT是植物體內(nèi)清除H2O2的重要酶類。POD是IAA 側(cè)鏈氧化酶，其能影響IAA的濃度[17]，POD活性與IAA含量呈反比。IAA對休眠解除起促進作用[18]。Patrick等[19]研究證明在休眠解除時期及萌發(fā)時期IAA 含量增加，馬鈴薯塊莖處于休眠狀態(tài)時POD活性較高，休眠解除過程中，POD活性下降。POD可能是調(diào)控馬鈴薯塊莖休眠的一種關鍵酶[17]。本試驗中鱗片中POD的活性在冷藏過程中持續(xù)下降，而頂芽和鱗莖盤中的活性在貯藏中后期卻有升高的趨勢，在后期POD對頂芽及鱗莖盤中H2O2的清除起了一定的作用。POD在鱗莖不同部位的活性變化說明頂芽及鱗莖盤和鱗片在解除休眠的過程并不是同步的，各種代謝相關酶在不同器官中的作用也不是完全相同的。低溫處理所引起的活性氧積累可能是百合鱗莖低溫破眠的原因之一。

一些報道認為抗壞血酸氧化酶參與了休眠解除的呼吸代謝過程[20]，在低溫處理36～60 d內(nèi)，ASP、CAT活性快速上升，后期趨于穩(wěn)定。可能是因為鱗莖在冷藏中后期適應低溫后逐漸解除休眠，鱗莖自身找到低溫條件下的代謝平衡點，當休眠破除，鱗莖萌發(fā)，細胞內(nèi)代謝水平?jīng)]有明顯變化，導致活性不再升高。SOD、POD在冷藏后期也沒有太大的波動。SOD活性最低點也出現(xiàn)在冷藏36～60 d，可見，36 d是鱗莖解除休眠的起點，60 d時鱗莖可能已經(jīng)解除休眠。在萌發(fā)實驗中，此時的鱗莖萌發(fā)率已達到75%。

PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一種末端氧化酶，和休眠塊莖中呼吸代謝有關，它可催化多酚類物質(zhì)氧化形成醌。孫紅梅等[4]指出百合鱗莖中雖然存在PPO和其天然底物酚類物質(zhì)，但由于活細胞中酶和底物定位的區(qū)域化，PPO活性與酚類物質(zhì)含量并不存在顯著相關關系。而且，PPO 活性變化與酚類物質(zhì)含量的變化在不同百合種類及不同園藝作物之間的變化也有很大差異。本實驗中，PPO在受到低溫誘導之后，酶活性在冷藏中后期有一個明顯上升的過程，王鵬等[17]在馬鈴薯冷藏試驗中發(fā)現(xiàn)，在冷藏初期PPO活性有升高趨勢，而整個冷藏期間活性變化不大。PPO與抗逆，抗病蟲、鱗莖的活力都有著密切的關系。鱗莖受到低溫的誘導并在破除休眠的過程中PPO活性增加。后期變化平緩，說明鱗莖沒有衰老的跡象。具有較強的生活力和抗逆性。劉艷萍[5]認為酚類物質(zhì)是休眠的抑制物質(zhì)，5℃低溫處理時，酚類物質(zhì)含量與PAL活性極顯著正相關，這與本實驗中 PAL在解除休眠過程中酶活性呈下降的趨勢是相符的，因而PAL可能是調(diào)控鱗莖休眠的一種關鍵酶。酚類物質(zhì)的合成都是在水溶性酚類物質(zhì)的基礎上進行的，苯丙氨酸的脫氨基是水溶性酚類物質(zhì)合成的第一步，PAL是催化這一過程的關鍵酶。酚類物質(zhì)容易氧化，PPO是酚類物質(zhì)氧化的關鍵酶[5]。因此，酚類物質(zhì)的抑制途徑可能是通過耗氧使百合鱗莖的頂芽萌發(fā)缺乏足夠氧氣，進而影響正常呼吸代謝過程，低溫可能是改變與酚類物質(zhì)合成和氧化相關酶的活性，進而影響酚類物質(zhì)的合成和氧化，使總酚含量下降，消除酚類物質(zhì)對百合鱗莖休眠解除的抑制作用，使頂芽恢復正常的呼吸代謝，最終休眠解除[5]。

總之，鱗莖在低溫解除休眠過程中，抗氧化酶活性的變化與休眠的解除是密切相關的。這些酶的活性變化，雖然存在著一定的共性，但它們的變化幅度，峰值出現(xiàn)的時間等還是有較大差別。要揭示百合鱗莖保護酶在低溫解除休眠過程中深層的代謝機制，抗氧化酶對鱗莖休眠解除的作用及各種酶間的互作等問題，還需要在具體的代謝途徑研究中進一步明確。

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Relationship between dormancy breaking and protective enzymes in refrigeratedLiliumpumilumbulbs

LIU Fang*, LI Dan-Dan, LIAN Hua, WU Xia, CHEN Ye-Wen, LI Yu-Qi, XIE Shou-Feng, CHEN Xue-Wu

CollegeofAgriculture,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China

Changes in bulb protective enzyme activity and carbohydrate content ofLiliumpumilumbulbs held at 5℃to break dormancy were investigated.Results showed that superoxide dismutase (SOD) activity of scales, apical buds and basal plates decreased within 0-24 days (d).Except for apical buds, peroxidase (POD) activity within 0-24 d declined in all bulb parts and catalase (CAT) activity of the outer scales, apical buds and basal plates decreased within 0-12 d.During middle and later periods, SOD, CAT and ascorbate peroxidase (ASP) increased, POD activity decreased, POD and polyphenol oxidase (PPO) activity of apical buds and basal plates also increased in the middle of the cold storage period.The roles of various metabolism related enzymes in different organs were not the same.With low temperature treatment for 36-60 d, ASP and CAT activity initially rapidly increased but later stabilized.The minimum value of SOD activity was found after 36-60 d cold storage.Starch content was negatively correlated with CAT, PPO, ASP, SOD and POD in all bulb parts; phenylalanine ammonia lyase (PAL) was positively correlated with starch in the scales.Bulb dormancy breaking started at 36 d, and was mostly complete at 60 d.

Liliumpumilum； bulb； dormancy; cold storage； protective enzymes

10.11686/cyxb2015031

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-20；改回日期：2015-04-24

黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關項目(HNK125BZD-02-17)和黑龍江八一農(nóng)墾大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(XC2015001)資助。

劉芳(1980-)，女，黑龍江雙城人，實驗師，博士。

*通信作者Corresponding author.E-mail：byndliufang@163.com

劉芳, 李丹丹, 廉華, 吳瑕, 陳業(yè)雯, 李雨琦, 謝守峰, 陳學武.細葉百合冷藏過程中鱗莖保護酶活性與休眠解除的關系.草業(yè)學報, 2015, 24(12):180-187.

LIU Fang, LI Dan-Dan, LIAN Hua, WU Xia, CHEN Ye-Wen, LI Yu-Qi, XIE Shou-Feng, CHEN Xue-Wu.Relationship between dormancy breaking and protective enzymes in refrigeratedLiliumpumilumbulbs.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):180-187.