通竅開玄法對鼻竇炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白相關(guān)基因影響研究*

敬 櫻，張?zhí)於稹鳎_再瓊，趙 靜，張勤修，楊九一

1成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

通竅開玄法對鼻竇炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白相關(guān)基因影響研究*

敬 櫻1，張?zhí)於?△，羅再瓊1，趙 靜1，張勤修2，楊九一1

1成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

目的：應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析通竅開玄法對鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜水通道蛋白（AQP）的影響，并探討其治療鼻竇炎的生物學(xué)機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組和正常組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組和模型組據(jù)Y.Gel的改良方法造模，正常組不做任何處理。造模成功后實(shí)驗(yàn)組分別給予三和通竅開玄湯低劑量組、三和通竅開玄湯中劑量組、三和通竅開玄湯高劑量組、青霉素V鉀片灌胃7天，處死動(dòng)物取鼻黏膜組織，應(yīng)用Agilent基因芯片檢測各組大鼠鼻黏膜水通道蛋白基因表達(dá)，并進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果：中藥各組均上調(diào)AQP1表達(dá)，中劑量組、高劑量組又上調(diào)AQP2，青霉素V鉀組上調(diào)AQP12b基因；4組均下調(diào)AQP9基因，中藥低劑量組還可下調(diào)AQP2、AQP12b，青霉素V鉀組還可下調(diào)AQP1、AQP2。結(jié)論：三和通竅開玄湯與青霉素V鉀片均對鼻竇炎具良好治療效果，但調(diào)控的AQP相關(guān)基因表達(dá)機(jī)制不同，且中藥組作用更為廣泛，表明對AQP相關(guān)基因的調(diào)控可能是通竅開玄法治療鼻竇炎生物學(xué)機(jī)制之一，AQP是玄府重要實(shí)質(zhì)之一。

鼻竇炎；基因芯片；通竅開玄法；水通道蛋白

水通道蛋白(a q u a p or i n，A Q P)是一組細(xì)胞膜上選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異孔道，它在體內(nèi)各系統(tǒng)組織中廣泛表達(dá)，除了在與體液分泌和呼吸密切相關(guān)的多種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)外，在一些與體液轉(zhuǎn)運(yùn)無明顯關(guān)系的組織細(xì)胞等處也有表達(dá)，它可能在多種器官生理和病理中發(fā)揮重要作用[1]。玄府是廣泛存在于機(jī)體五官九竅、臟腑內(nèi)外的微觀孔竅，具有流通氣液、滲灌氣血等作用，是迄今為止中醫(yī)學(xué)有關(guān)人體結(jié)構(gòu)層次中最為細(xì)小的單位，與A Q P有較多的共性[2]。本課題組前期研究顯示運(yùn)用通竅開玄法治療鼻竇炎模型大鼠效果顯著，認(rèn)為可能與通竅開玄法調(diào)控A Q P有關(guān)。因此，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，從基因表達(dá)水平探討開竅通玄法對鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜水通道蛋白影響，揭示通竅開玄法治療鼻竇炎的生物學(xué)機(jī)制，為通竅開玄法提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 S D大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 實(shí)驗(yàn)用藥三和通竅開玄湯（白芷10 g，細(xì)辛3 g，辛夷10 g，鵝不食草12 g，黃芩10 g），由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室，按照國家標(biāo)準(zhǔn)制劑工藝制成研究用藥液。藥液濃度為每毫升含生藥2 g（2 g/mL）。青霉素V鉀片：市售，5～18.7m g/（kg·d-1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 T R I Z OL試劑 (貨號：15596-018，L i f e tec h n o l o g i es，Car l sbad，CA，U S）、R N A迷你提取試劑盒 (貨號：74106，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)、R N ase-f ree D N ase set試劑 (貨號：79254，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)、Low I n p u t Q ui c k Am p Labe l i ng K i t（貨號：5190-2305，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S），O n e-Co l or、R N A S p i k e-I n K i t（貨號：5190-2305，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、O n e-Co l or、Ge n e E x p ress i o n K i t（貨號：5188-5242，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、Ge n e E xp ress i o n W as h B u f f er K i t（貨號：5188-5327，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 安捷倫生物分析儀2100(A g il e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S)、雜交爐（型號：G2545A，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、sta i n i ng d i s h es(型號：121，T h ermo S h a n do n，W a l t h am，M A，U S)、安捷倫芯片掃描儀（型號：G2565CA，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物造模分組 實(shí)驗(yàn)S D大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]的方法：隨機(jī)取60只大鼠，按0.5m g/kg腹腔注射氯胺酮全身麻醉，同時(shí)用利多卡因1.52～2.0mL(20m g/mL)配腎上腺素0.0125m g，鼻背下浸潤麻醉，在面中線上中1/3交界處旁3mm以45度角作切口，塞入帶有金葡萄球菌的明膠海綿于內(nèi)，縫合切口，建立急性鼻竇炎大鼠模型。造模第7天后，隨機(jī)抽取正常大鼠5只及模型大鼠5只處死，進(jìn)行模型評價(jià)。其余模型大鼠隨機(jī)分為中藥高劑量組、中藥中劑量組、藥低劑量組、青霉素V鉀組、模型對照組，前余10只大鼠為正?？瞻讓φ战M。每組10只，共60只。

1.5.2 給藥 從造模成功后的第1天開始灌胃連續(xù)7天，每日各組均早晚兩次灌服。中藥高劑量組，每日以相當(dāng)于臨床成人劑量20倍的藥物灌胃（50mL·kg-1·d-1)；中藥中劑量組，每日以相當(dāng)于臨床成人劑量10倍的藥物灌胃（25mL·kg-1·d-1)；中藥低劑量組，每日以相當(dāng)于臨床成人劑量5倍灌胃（15mL·kg-1·d-1)；青霉素V鉀片組，每日以相當(dāng)于臨床成人劑量5倍的青霉素V鉀片制成混懸液灌胃(含藥量10m g·kg-1·d-1)。模型對照組：造模后，每日以等量生理鹽水灌胃。正常空白對照組：不灌胃，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.5.3 標(biāo)本的采集與處理 于灌胃結(jié)束后次日處死大鼠，在超凈臺(tái)冰盤上摘取鼻黏膜組織，無R n ase P B S緩沖液沖洗兩次，放入凍存管，置液氮罐保存，備提取 R N A。根據(jù)試劑盒說明書R N easy m i n i k i t(Cat#74106，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)和R N ase-Free D N ase S et(Cat#79254，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的總R N A抽提，并純化總R N A，經(jīng)安捷倫2100芯片生物分(A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S)電泳質(zhì)檢。

1.5.4 基因芯片檢測 質(zhì)檢合格的R N A進(jìn)行單熒光標(biāo)記，利用A g i l e n t大鼠全基因4×44K芯片檢測，依次進(jìn)行芯片雜交、洗滌，采用安捷倫芯片掃描儀進(jìn)行掃描獲取熒光信號。用Feat u re E xt ract i o n so f tware 10.7(A g i l e n t tec h n o l og i es，S a n ta C l ara，CA，U S)采轉(zhuǎn)換熒光信號為數(shù)值，最后采用Ge n e S p r i ng S o f tware 11.0進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Q u a n t i l e，獲取各組基因表達(dá)值。

1.5.5 各組差異基因情況分析 用E x ce l計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與模型對照組基因表達(dá)rat i o值，通常設(shè)定差異倍數(shù)的閾值為小于0.5或大于2為基因差異評判標(biāo)準(zhǔn)，大于2表示基因上調(diào)2倍，小于0.5表示基因下調(diào)2倍。分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與模型對照組相比：中藥低劑量組得到4 632條差異基因，中藥中劑量組得到5 397條差異基因，中藥高劑量組得要5 348條差異基因，青霉素V鉀組得到352條差異基因。

2 結(jié)果

2.1 聚類分析 利用斯坦福大學(xué)C l u st r和T ree v i ew軟件，過濾數(shù)據(jù)，以At l east 1 observ at i o n s w i t h abs=4.0，M a x Va l-M i n Va l≥2.0可以清楚看到c D N A微陣列中5 572個(gè)基因在空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、青霉素V鉀片組比較后的基因表達(dá)情況，其中每個(gè)小格代表一個(gè)基因，黑色表示無差異，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，顏色的變化程度與基因表達(dá)的差異性成正比。從圖1中可以看出中藥各劑量組、青霉素V鉀組均和空白組聚類，說明藥物治療有效。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對照組聚類分析圖

2.2 基因芯片的生物信息學(xué)分析 利用K E GG數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因生物學(xué)通路，中藥低劑量組差異基因涉及278條通路改變、中藥中劑量組差異基因涉及276條通路改變、中藥高劑量組差異基因涉及277條通路改變，青霉素V鉀片組差異基因涉及193條通路改變，各組均涉及了包括炎癥發(fā)生、抗原提呈、補(bǔ)體激活等免疫學(xué)通路等，體現(xiàn)了各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在炎癥的本質(zhì)。

用藥組與模型組比較，在所有差異基因中，篩選出了水通道蛋白差異基因。目前A Q P已在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了13種(A Q P0-A Q P12)[4]，課題組通過篩選僅發(fā)現(xiàn)A Q P1、A Q P2、A Q P9、A Q P12b四種水通道蛋白基因出現(xiàn)在本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。四種水通道蛋白基因表達(dá)情況如圖2所示，可見中藥組對水通道蛋白基因有明顯調(diào)控作用。中藥各劑量組和青霉素V鉀組與模型組比對這四種A Q P基因的調(diào)控如圖3—4所示，可見中藥低劑量組主要上調(diào)了A Q P1水通道蛋白基因，中劑量組與高劑量組主要上調(diào)了A Q P1、A Q P2水通道蛋白基因，而青霉素V鉀組主要上調(diào)了A Q P12bA Q P基因；中藥低劑量組主要下調(diào)了A Q P9、A Q P2、A Q P12bA Q P基因，中劑量組與高劑量組則主要下調(diào)了A Q P9、A Q P12b水通道蛋白基因，而青霉素V鉀組主要下調(diào)了A Q P1、A Q P2、A Q P9水通道蛋白基因，4組均下調(diào)了A Q P9水通道蛋白基因。

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對照組聚類分析圖1

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對照組聚類分析圖2

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對照組聚類分析圖3

3 討論

課題組前期提出了鼻腔玄府學(xué)說與“雙竅閉塞、雙毒互結(jié)”的鼻竇炎發(fā)病新觀點(diǎn)[4-5]，認(rèn)為玄府廣泛存在于鼻腔鼻竇的黏膜，其有序的開闔維持著氣液在鼻腔鼻竇黏膜的循環(huán)交通，保證了鼻腔鼻竇黏膜的正常形態(tài)及生理功能[6]。而外邪入侵、邪毒內(nèi)生郁阻鼻中竇竅與玄府，導(dǎo)致雙竅閉塞是鼻竇炎發(fā)病的重要機(jī)制，因此在治療上應(yīng)以“通鼻竅、開玄府”為治則，形成“三和通竅開玄湯”加減治療。方中白芷燥濕升陽，細(xì)辛、辛夷芳香祛濕，鵝不食草散風(fēng)利肺，黃芩燥濕解毒，諸藥共用，通竅開玄，治療Ⅰ型、Ⅱ型1期的鼻竇炎患者225例，總體療效達(dá)85%以上[5]。本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)探討通竅開玄法對鼻竇炎模型大鼠鼻黏膜A Q P影響。研究表明三和通竅開玄湯不同劑量組和青霉素V鉀組均可治療鼻竇炎模型大鼠，其生物學(xué)機(jī)制可能與良性調(diào)控水通道蛋白有關(guān)。

我們認(rèn)為A Q P可能是玄府重要實(shí)質(zhì)之一，兩者都具有普遍存在性、結(jié)構(gòu)微觀性，功能上均可流通水液[2]。本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)三和通竅開玄湯不同劑量組可分別調(diào)控A Q P1、A Q P2、A Q P9、A Q P12b四種水通道蛋白基因表達(dá)，且表達(dá)明顯。研究發(fā)現(xiàn)：A Q P l在消化道黏膜下層和固有層的小血管、小腸中央乳糜管內(nèi)皮以及涎腺、唇腺腺泡的基膜有分部[7]、血管新生過程中[8]、鼻黏膜組織、肌肉組織、結(jié)締組織、神經(jīng)組織、腫瘤組織等多種組織中表達(dá)[9]；A Q P2分布于腎及與內(nèi)淋巴代謝有關(guān)的結(jié)構(gòu)中[4]；A Q P9在子癇前期胎盤[10]、合體細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的頂質(zhì)膜、羊膜上皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞膜、生精小管內(nèi)表面等部位都有分布[11]；A Q P l2僅分布于胰腺的腺泡細(xì)胞上和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器上[4]。既往文獻(xiàn)報(bào)道中除了A Q P1在鼻黏膜中有分布，其余三個(gè)A Q P基因均未被報(bào)道可分布于大鼠鼻黏膜中。而本次實(shí)驗(yàn)則見A Q P2、A Q P9、A Q P12b分布于大鼠鼻黏膜，尚屬首次報(bào)道，進(jìn)一步證實(shí)了水通道蛋白可能是玄府重要實(shí)質(zhì)之一。

綜上所述，鼻中玄府閉郁是鼻竇炎發(fā)病的基本病機(jī)，通竅開玄法是治療鼻竇炎的有效方法，其發(fā)揮療效的生物學(xué)機(jī)制可能與調(diào)控水通道蛋白有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，三和通竅開玄湯與青霉素V鉀均可治療鼻竇炎大鼠，但中藥組作用更為廣泛，其治療機(jī)制不同，尚需進(jìn)一步研究。

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Research on the Influenceof TongQiao KaiXuan Method on AQP-related GeneofNasal Mucosa in Ratsw ith Nasosinusitis

JING Ying1,ZHANG Tian'e△1,LUO Zaiqiong1,ZHAO Jing1,ZHANG Qinxiu2,YANG Jiuyi1
1 Basic Medical School of Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China; 2 Teaching Hospital of Chengdu University of TCM

nasosinusitis;gene chip;TongQiao KaiXuan method;aquaporin

R285-5

A

1004-6852(2015)08-0008-04

2014-10-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81072727)；四川省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(編號：09ZA022)。

敬櫻(1989—)，女，碩士學(xué)位。研究方向：中醫(yī)治則治法。

△通訊作者：張?zhí)於?1970—)，女，碩士研究生導(dǎo)師，研究員。研究方向：證候的生物學(xué)基礎(chǔ)。

Abst ract Objective:To analyze theeffectsof TongQiao KaiXuan method on aquaporin(AQP)of nasalmucosa in ratmodelw ith nasosinusitis by gene chip technology,and discuss its biologicalmechanism of treating nasosinusitis.Methods:The ratswere random ized into the experimentgroup,themodelgroup and the normalgroup,the rats in the experimentgroup and themodel group were prepared by Y.Gel reformingmethod,the normalgroup were unhandled.A fter successfully establishing themodels,the experimentgroup accepted intragastric adm inistration of San-He TongQiao KaiXuan Tang in high,moderateand low dose,and phenoxymethylpenicillin potassium tablets for seven consecutive days,nasalmucosawas obtained from the animals,the AQPexpressions of the rats in all the groupswere detected with Agilentgene chip,and analyzed significantly.Results:AQP1 expressions raised in the groups of TCM, AQP2 expressions raised inmoderate and high doses groups,AQP12b genewas up-regulated in phenoxymethylpenicillin potassium tablets group;AQP9 gene was down-regulated in four groups,AQP2 and AQP12b decreased in low dose groups of TCM,AQP1 and AQP2 were down-regulated in phenoxymethylpenicillin potassium tablets group. Conclusion:SanHe TongQiao KaiXuan Tang and phenoxymethylpenicillin potassium tablets show better clinical effects in treating nasosinusitis,but themechanisms of regulating AQP-related gene expression are different,and the functionsof TCM groupsare extensive,which demonstrates the regulation of AQP-related genesmightbe one of biologicalmechanismsof TongQiao KaiXuan method in treating nasosinusitis,AQP isone of the importantsubstancesof the sweatpores.