甘肅當(dāng)歸對(duì)乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預(yù)作用*

鄧 毅，張 明，張艷萍

1甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

甘肅當(dāng)歸對(duì)乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預(yù)作用*

鄧 毅1，2，張 明2，張艷萍3

1甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

目的：比較甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏不同產(chǎn)地當(dāng)歸對(duì)乙酰苯肼溶血性血虛小鼠的干預(yù)作用。方法：建立乙酰苯肼溶血性血虛模型，給予當(dāng)歸水煎液［1.56 g/(kg·d）］22天后，檢測(cè)外周血紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（H G B）、紅細(xì)胞壓積（H CT）、白細(xì)胞（W BC）、血小板（PLT）、紅細(xì)胞膜鈉-鉀-A TP酶（N a+-K+-A TP）和鈣-鎂-A TP酶（Ca2+-M g2+-A TP）活性，并觀察肝臟指數(shù)（LI）、脾臟指數(shù)（SI）、胸腺指數(shù)（TI）的變化。結(jié)果：與模型組比較，岷縣當(dāng)歸能提高RBC、H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），臨夏當(dāng)歸能提高H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），渭源當(dāng)歸能提高H G B、H CT降低PLT（P＜0.05），禮縣當(dāng)歸能降低PLT（P＜0.05）；岷縣當(dāng)歸能提高N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05），禮縣當(dāng)歸能提高N a+-K+-A TP酶活性（P＜0.05），臨夏當(dāng)歸能提高Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05）；甘肅產(chǎn)各當(dāng)歸均能降低LI（P＜0.05），有降低SI的趨勢(shì)，岷縣、禮縣、渭源當(dāng)歸能升高TI（P＜0.05）。結(jié)論：甘肅當(dāng)歸［1.56 g/(kg·d）］具有明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象相關(guān)指標(biāo),提高紅細(xì)胞膜A TP活性，降低肝脾指數(shù)，升高胸腺指數(shù)的作用，綜合比較岷縣當(dāng)歸作用較強(qiáng)。

甘肅當(dāng)歸；溶血性血虛；外周血象；紅細(xì)胞膜A TP酶；器官指數(shù)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv) Diels.的根，主產(chǎn)于甘肅省東南部的岷縣(秦州)，其性甘溫質(zhì)潤(rùn)，長(zhǎng)于補(bǔ)血，為“補(bǔ)血之圣藥”［1］。甘肅岷縣當(dāng)歸歷代均被譽(yù)為道地藥材，《本草求真》云：“當(dāng)歸專入心。辛甘溫潤(rùn)，諸書(shū)載為入心生血上品?！惫视卯?dāng)歸補(bǔ)心血，心得血養(yǎng)則諸證自除［2］。本實(shí)驗(yàn)考察甘肅不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸對(duì)乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預(yù)作用，為當(dāng)歸的補(bǔ)血作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 2013年3月購(gòu)試驗(yàn)所用當(dāng)歸于甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏及云南，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室楊扶德教授鑒定為正品。當(dāng)歸水煎液的制備：稱取各產(chǎn)地當(dāng)歸10 g，分別加水80 mL，浸泡30分鐘，煎煮60分鐘，過(guò)濾，收集藥液，藥渣中再加入60 mL水煎煮30分鐘，過(guò)濾，合并兩次濾液，水浴濃縮至100 mL，含生藥量0.1 g/mL，3～4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。驢膠補(bǔ)血顆粒(九芝堂股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2012080220)，水溶液制備：取驢膠補(bǔ)血顆粒30 g，加生理鹽水配制成90 mL溶解，含原藥量0.33 g/mL。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠128只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2013-0002。

1.3 試劑 肝素鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)：F20091231)；乙酰苯肼(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20130313)；ATP酶測(cè)試盒(批號(hào)：20130423)，蛋白質(zhì)快速染色試劑盒(批號(hào)：20130503)，考馬斯亮藍(lán)G250法，均購(gòu)于南京建成科技有限公司。

1.4 儀器 Abacus Junior vet5動(dòng)物血球儀(美國(guó)ABBOTT公司提供)；MODEL680酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司提供)；Boifuge stratos高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)科俊儀器公司提供)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司提供)；XH-B漩渦混勻器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司提供)。

1.5 方法

1.5.1 溶血性血虛小鼠模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)方法［4-5］，除空白對(duì)照組外，其余7組小鼠分別于灌胃第1、4、7、12、17、22天進(jìn)行皮下注射2%乙酰苯肼(APH)溶液，第一次劑量為200 mg/kg，其余每次劑量為100 mg/kg。

1.5.2 分組與給藥 將128只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(驢膠補(bǔ)血顆粒組)、岷縣當(dāng)歸組、禮縣當(dāng)歸組、渭源當(dāng)歸組、臨夏當(dāng)歸組、云南當(dāng)歸組，每組16只。模型建立后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組按15.6 mL/kg生理鹽水灌胃；各當(dāng)歸藥物組給藥劑量根據(jù)成人劑量12 g/70(kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量1.56 g/(kg·d)（含生藥量0.1 g/mL），故各當(dāng)歸組均按15.6 mL/kg劑量(含生藥量0.1 g/mL)灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組給藥劑量根據(jù)成人劑量40 g/70 (kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量5.2 g/(kg·d)(含藥量0.33 g/mL)，灌胃劑量為15.6 mL/(kg·d)。以上各組灌胃1次/d，連續(xù)22天。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 外周血象指標(biāo)的檢測(cè) 所有各組于末次給藥24小時(shí)后，眼眶取血20 μL，加入已添加肝素鈉的離心管中，用移液槍輕微混勻，采用動(dòng)物血球儀測(cè)定RBC、HGB、HCT、WBC、PLT。

1.6.2 紅細(xì)胞膜A TP酶活性的檢測(cè) 眼眶取血后，各組小鼠股動(dòng)脈采血(肝素鈉抗凝)，加4倍生理鹽水，使用冷凍離心機(jī)3 000 r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，在沉淀的紅細(xì)胞中加入0.75mL雙蒸水，渦旋30秒，放置15分鐘，再渦旋30秒，再放置15分鐘，使其充分溶血，直至溶質(zhì)透亮［6］。嚴(yán)格按ATP酶試劑盒(定磷法)操作說(shuō)明測(cè)定紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.6.3 肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)測(cè)定 小鼠取血后處死，取肝臟、脾臟、胸腺稱重，以mg/g單位計(jì)算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

肝臟指數(shù)(LI)=肝臟濕重×1 000/體質(zhì)量(單位g)

脾臟指數(shù)(SI)=脾臟濕重×1 000/體質(zhì)量；胸腺指數(shù)(TI)=胸腺濕重×1000/體質(zhì)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周RBC、H G B、H CT、W BC、PLT檢測(cè)結(jié)果 模型組的RBC、HGB、HCT和WBC、PLT與空白組比較有顯著下降和上升(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當(dāng)歸能提高RBC、HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，臨夏當(dāng)歸能提高HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，渭源當(dāng)歸能提高HGB、HCT及降低PLT(P＜0.05)，禮縣當(dāng)歸能降低PLT(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 紅細(xì)胞膜N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性檢測(cè)結(jié)果 模型組的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與空白組比較有顯著下降(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當(dāng)歸能提高 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)，禮縣當(dāng)歸能提高Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05)，臨夏當(dāng)歸能提高Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)測(cè)定 模型組的LI、 SI和TI與空白組比較有顯著上升和下降(P＜0.05)。與模型組比較，甘肅各當(dāng)歸均能降低LI(P＜0.05)，有降低SI的趨勢(shì)，岷縣、禮縣、渭源當(dāng)歸能升高TI(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表1 對(duì)小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

表1 對(duì)小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與空白組比較，◇◇表示P＜0.01（下同）。

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1）RBC(×1012)/L H G B/(g·L-1) H CT/% W BC(×109)/L PLT×109/L空白對(duì)照 16 - 13.48±2.21 377.67±44.02 59.27±9.05 7.08±2.28 838.63±201.07模型對(duì)照 16 - 8.29±2.31◇◇276.87±9.05◇◇45.67±12.14◇◇13.57±4.84◇◇1295.43±180.05◇◇陽(yáng)性對(duì)照 16 5.20 9.83±1.14*325.94±15.96**54.38±7.04**7.77±3.78**917.73±280.32**岷縣當(dāng)歸 16 1.56 10.69±1.65**326.47±34.18**59.69±8.94**9.14±3.53**868.73±204.75**禮縣當(dāng)歸 16 1.56 9.29±0.82 300.47±17.42 51.59±5.08 12.02±4.16 918.80±159.23**渭源當(dāng)歸 16 1.56 9.23±1.52 314.00±20.62**55.02±5.47**11.36±3.08 1054.00±211.82**臨夏當(dāng)歸 16 1.56 9.44±1.35 304.13±24.80*52.30±7.29*9.66±3.39**1079.00±213.81**云南當(dāng)歸 16 1.56 9.18±1.67 324.64±28.68 51.08±8.60 9.58±3.08 1107.47±242.95

表2 對(duì)小鼠紅細(xì)胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

表2 對(duì)小鼠紅細(xì)胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） N a+-K+-A TP Ca2+-M g2+-A TP空白對(duì)照 16 - 26.86±9.74 43.20±14.53模型對(duì)照 16 - 11.64±6.17◇◇14.44±8.69◇◇陽(yáng)性對(duì)照 16 5.20 24.24±10.22**36.84±14.70**岷縣當(dāng)歸 16 1.56 23.98±8.55**32.74±7.28*禮縣當(dāng)歸 16 1.56 21.75±5.81*27.17±16.63渭源當(dāng)歸 16 1.56 18.04±7.86 21.54±15.31臨夏當(dāng)歸 16 1.56 13.07±8.50 31.94±16.84*云南當(dāng)歸 16 1.56 18.76±8.64 26.84±13.81

表3 對(duì)小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

表3 對(duì)小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） LI/(m g·g-1) SI/(m g·g-1) TI/(m g·g-1)空白對(duì)照 16 - 32.92±3.66 2.09±0.49 2.23±0.82模型對(duì)照 16 - 48.48±5.39◇◇11.95±2.26◇◇1.48±0.50◇◇陽(yáng)性對(duì)照 16 5.20 41.55±1.98**10.13±2.34*2.18±0.80*岷縣當(dāng)歸 16 1.56 40.92±2.53**10.74±1.76 2.17±1.16*禮縣當(dāng)歸 16 1.56 44.76±3.25*11.82±2.32 2.05±0.83*渭源當(dāng)歸 16 1.56 43.16±3.03**11.11±2.18 2.05±0.62*臨夏當(dāng)歸 16 1.56 44.21±4.59**11.69±3.45 1.95±0.52云南當(dāng)歸 16 1.56 46.87±6.96 11.26±2.64 2.09±0.64

3 討論

溶血性貧血(hemolytic anemia)是指紅細(xì)胞破壞加速，骨髓造血功能代償不足時(shí)發(fā)生的貧血，多見(jiàn)于紅細(xì)胞自身異常和紅細(xì)胞外部異常兩類(lèi)。有分析認(rèn)為血虛與情志、不良飲食、體質(zhì)、疾病、失血、生育、藥毒損傷有關(guān)［7］。本實(shí)驗(yàn)采用乙酰苯肼建立溶血性血虛模型，誘導(dǎo)小鼠外周RBC、HGB、 HCT降低，WBC、PLT升高，紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP活性降低，肝脾腫大，胸腺萎縮。RBC為運(yùn)送氧氣的主要媒介且具免疫功能；HGB含量的高低代表著血虛的程度；HCT反映紅細(xì)胞的濃度；WBC為免疫細(xì)胞，具有吞噬異物產(chǎn)生抗體的作用；PLT在止血過(guò)程發(fā)揮重要作用［8］。紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整是紅細(xì)胞發(fā)揮功能的重要保證，而紅細(xì)胞的功能主要是通過(guò)膜蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜內(nèi)高鉀，膜外高鈉的平衡，能將ATP分解為ADP并產(chǎn)生能量，對(duì)維持紅細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用，在血虛狀態(tài)下其活力明顯降低［9］；Ca2+-Mg2+-ATP維持細(xì)胞外高鈣，細(xì)胞內(nèi)高鎂的水平，亦可分解ADP以獲得能量［10］。中醫(yī)認(rèn)為肝藏血，脾統(tǒng)血為“氣血生化之源”，肝脾的功能失常可以引起血虛。脾臟是人體最大的免疫器官，因此脾臟腫大、胸腺萎縮，將導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，在一定程度會(huì)引起機(jī)體造血機(jī)能的低下，表現(xiàn)為中醫(yī)血虛的病癥［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘肅當(dāng)歸能明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象，提高紅細(xì)胞膜ATP酶活性，降低肝脾指數(shù)，升高胸腺指數(shù)，對(duì)乙酰苯肼溶血性血虛小鼠具有較好的治療作用，綜合比較岷縣當(dāng)歸作用較強(qiáng)。

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Intervention of Gansu DangGui on the Mice Models with Acetyl Phenyl Hydrazine-induced Hemolytic Blood-deficiency

DENG Yi1,2,ZHANG Ming2,ZHANG Yanping3
1 Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province(nurturing station),Lanzhou 730000,China;2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine; 3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective:To compare the intervention of DangGui(Angelica sinensis)of Minxian,Lixian, Weiyuan,Linxia ofGansu province on mice models with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency. Methods:The model with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency was established and given DangGui water decoction[1.56 g/(kg·d)]for 22 days,to detect red blood cells(RBC),hemoglobin(HGB),hematocrit(HCT),white blood cells(WBC),platelet(PLT),the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme in red cell membrane,and observe the changes of liver index (LI),spleen index (SI)and thymus index(TI). Results:Compared with the model group,Minxian Danggui could raise RBC,HGB and HCT but decrease WBC and PLT(P＜0.05),Linxia Danggui could increase HGB and HCT but lower WBC and PLT(P＜0.05),Weiyuan Danggui could increase HGB and HCT,but decrease PLT (P＜0.05),Lixian Danggui could decrease PLT (P＜0.05); Minxian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05),Lixian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme(P＜0.05),Linxia Danggui could improve the activity of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05);Gansu Danggui could lower LI(P＜0.05),showing the tendency of decreasing SI, Minxian,Lixian and Weiyuan Danggui could increase TI(P＜0.05).Conclusion:Gansu Danggui[1.56 g/(kg·d)] could improve the related indexes in peripheral blood of mice with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency obviously,improve the activity of ATP in red blood cell membrane eividently,decrease liver and spleen indexes and increase TI,and Minxian Danggui shows the strongest function comprehensively.

Gansu DangGui;hemolytic blood-deficiency;peripheral blood;ATP enzyme of red blood cell membrane;organ index

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0005-04

2014-12-27

甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(編號(hào)2009-4)。

鄧毅(1964—)，男，博士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥及復(fù)方藥效基礎(chǔ)的應(yīng)用研究。