苦豆子籽總生物堿分離純化工藝研究

郭鴻雁，冷曉紅，陳海燕，郝彩琴

1寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心

苦豆子籽總生物堿分離純化工藝研究

郭鴻雁1，2，冷曉紅1，2，陳海燕1，2，郝彩琴1，2

1寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心

目的：選用大孔樹脂純化苦豆子籽提取液的生物堿的純度，提高生物堿的純度。方法：pH=9，濃度為2.0～2.5 m g/m L的料液，抽濾加氯化鈉(1.0 m ol/L)，以樹脂重量與樣品的體積比為1∶3上柱，用3倍樣品體積pH=9的30%乙醇先洗脫，再用3倍樣品體積pH=9為70%乙醇洗脫。結(jié)論：選用非極性D 101大孔樹脂直接從苦豆子籽提取液中分離純化生物終產(chǎn)品總堿純度可達(dá)60%以上，洗脫率為97%以上，分離效果好。

苦豆子籽；大孔樹脂；分離純化

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)為豆科植物的干燥全草及種子。產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、新疆等地。由于其較高的藥用價值和生態(tài)功能，苦豆子資源的合理保護與開發(fā)利用越來越引起人們的重視，寧夏回族自治區(qū)已將苦豆子列入重點保護的六大道地藥材之一，納入國家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)行動計劃中，生產(chǎn)基地建設(shè)和深層次開發(fā)都有長足的發(fā)展。苦豆子味極苦、性寒有毒，具有清熱解毒，抗菌消炎、止痛殺蟲等作用。目前苦豆子籽的分離純化方法常采用溶劑提取、離子樹脂交換法。溶劑提取不利點是因使用有機溶劑多為甲苯、氯仿、甲醇，對環(huán)境、人體存在一定危害并殘存于提取物中；離子樹脂交換法一般是利用陽離子樹脂的酸根與生物堿的胺基基團作用，將生物堿富集在樹脂上，再用堿液將生物堿解離，得到游離的生物堿，缺點是生物堿與樹脂的結(jié)合力強，不能將生物堿完全洗出，所以主要生物堿的損失較大，本實驗選用大孔樹脂與離子樹脂不同的是不交換基團，它主要是依靠物質(zhì)間范德華力、偶極力和氫鍵力來進行物質(zhì)間的分離。本實驗大孔吸附樹脂對苦豆子籽中的生物堿進行分離，先通過靜態(tài)吸附與解吸實驗選出最佳樹脂；然后通過動態(tài)吸附實驗考察上柱量、上柱液pH等因素對吸附率的影響，確定最佳上柱條件；找出最佳的洗脫條件。常用的洗脫劑有：甲醇、乙醇、四氯化碳、丙酮、水等，為減少產(chǎn)品的有害溶劑殘留及降低環(huán)境污染，本實驗選用乙醇與水。

本實驗選用非極性D101大孔樹脂直接從苦豆子籽提取液中分離純化生物終產(chǎn)品總堿純度可達(dá)60%以上，洗脫率在97%以上，分離效果好，該法的優(yōu)點是生物堿吸附速度快，洗脫容易，樹脂的壽命長，為其產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保障，使其易于生產(chǎn)，創(chuàng)造更大的社會效益和經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 苦豆子提取液，實驗室制備；溴麝香草酚藍(lán)，分析純，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供；乙醇，分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；鹽酸，分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；氫氧化鈉分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；pH試紙，上海黃海試劑廠生產(chǎn)；D101樹脂(實驗級)、AB-8樹脂(實驗級)，上海天蓮樹脂有限公司生產(chǎn)；中極性樹脂BS-30(實驗級)、弱極性樹脂BS-67-2(實驗級)、非極性樹脂BS-67-3(實驗級)，蚌埠市遼源生物科技有限公司生產(chǎn)；槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿，由中國食品藥品生物鑒定所提供；碘化鉍鉀，分析純，天津雙雙試劑有限公司提供。

1.2 儀器 BT-101電子蠕動泵(上海信宜儀器有限公司生產(chǎn))，RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮實驗儀器有限公司生產(chǎn))，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城儀器有限公司生產(chǎn))，XS105DU電子天平(梅特勒生產(chǎn))，TU-1810紫外可見分光計(北京普析色譜儀器有限公司生產(chǎn))，1220高效液相色譜儀(美國安捷倫公司生產(chǎn))，Φ2 cm×50 cm、 Φ150cm×1 000 cm層析柱(定制)，HG90708恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗儀器有限公司生產(chǎn))，LD-S-10［1］低速離心機(北京時代北利離心機有限公司生產(chǎn))。

1.3 實驗方法

1.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 將20 g樹脂使用95%的乙醇溶液浸泡24小時，保證樹脂充分溶脹，濕法裝柱，柱高60 cm，直徑15 cm，用乙醇95%溶液淋洗至洗脫液與水混合(1∶2)不成白色混濁為止，再用純化水洗至無醇味，2%的鹽酸溶液浸泡3小時，水洗至中性流數(shù)為4～6 BV/h，5%氫氧化鈉溶液浸泡3小時，水洗至中性流數(shù)為4～6 BV/h，備用。

1.3.2 大孔樹脂篩選 對弱極性、非極性、中極性樹脂進行比較篩選。取苦豆子籽濃縮提取液適量2%NaOH調(diào)pH至9，離心、過濾備用。將經(jīng)過預(yù)處理過的樹脂，加入濃縮樣波美度5(下總堿都是以五總堿計，5種堿為氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參堿、槐果堿)供試液70mL，濃度2.20mg/mL，上樣總堿量154 mg，靜止24小時，使之充分吸附，取流出液用液相測定總堿，6倍上樣體積70%乙醇洗脫柱6次，使用洗脫劑共計300 mL，收集洗脫液測總堿。見表1。

表1 大孔樹脂篩選

吸附率=(吸附前上樣總堿量-吸附后續(xù)濾液總堿量)/吸附前上樣總堿量×100%

洗脫率=洗脫出總堿量/吸附總堿量×100%得出非極性樹脂吸附與洗脫性能良好。

1.3.3 非極性樹脂篩選 經(jīng)過預(yù)處理過非極性樹脂D101、AB-8、BS-67-3加入供試液上樣供試液70 mL，濃度2.20 mg/mL，上樣總堿量154 mg使之充分吸附，取續(xù)濾液用液相測定總生物堿，6倍上樣體積70%乙醇洗脫柱6次，使用洗脫劑共計300mL，收集洗脫液測總堿。得出D101樹脂吸附與洗脫性能良好。見表2。

表2 非極性樹脂篩選

1.4 吸附液pH考察 處理D101樹脂柱10根(2cm×50cm)，樹脂量為20g，樣品濃度為2.29mg/mL (液相測得)，分別用2%鹽酸與5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)不同數(shù)值pH上樣，用改良碘化鉍鉀試液噴在濾紙上，檢測流出液中是否有生物堿，如果濾紙試紙變色，則有生物堿流出，無變色繼續(xù)上樣，直至變色為止。得出pH4、pH9、pH10吸附總堿量高，樹脂的耐受范圍pH4～10，取pH9上樣。見表3。

表3 吸附液pH考察

1.5 不同乙醇洗脫液濃度的考察 配制不同濃度的乙醇作為洗脫液，洗脫以上3.4吸附柱，6倍上樣體積不同濃度乙醇洗脫柱6次，收集洗脫液，用液相測總堿。得出洗脫乙醇濃度在30%～70%之間洗脫生物堿量高，極性強的生物堿在低濃度洗脫量高，非極性生物堿在高濃度洗脫量高。見表4。

表4 不同乙醇洗脫液濃度的考察

1.6 樣品中加氯化鈉對吸附量的考察 生物堿在吸附過程中加入氯化鈉，因鹽析的作用降低生物堿的溶解趨勢，顯著增加吸附速度及吸附容量，從而與其他成分分離，提高樹脂的分離純化提取率，但氯化鈉的量的加入有一定的范圍，通過上樣樣品中(濃度2.20 mg/mL液相測得)加入不同濃度的氯化鈉，再加入樹脂柱中，用改良碘化鉍鉀試液噴在濾紙上，檢測流出液中是否有生物堿，如果濾紙試紙變色，則有生物堿流出，無變色繼續(xù)上樣，直至變色為止。見表5。

表5 樣品中加氯化鈉對吸附量的考察

顯然，隨著NaCl濃度的增大吸附量也隨著增大，然而NaCl濃度大于1 mol/L以后，增加NaCl濃度，樹脂對生物堿吸附的量無增加，并且濃度越大將來對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕越強，因此上柱液的鹽離子濃度定為1 mol/L。因該大孔樹脂對Na+，Cl-均不吸附，故添加NaCl對于生物堿純度及活性并無影響。

1.7 不同PH 70%乙醇洗脫劑洗脫率考察 使用3.6吸附樣品的樹脂柱進行不同pH70%乙醇洗脫劑實驗，6倍上樣體積不同pH70%乙醇洗脫柱6次，收集洗脫液，液相測總堿。見表6。

表6 不同pH 70%乙醇洗脫劑洗脫率考察

pH是9，70%的洗脫率最高。

1.8 不同梯度濃度洗脫液的考察 樣品加濃度為1.0 mol/L的氯化鈉，濃度為2.20mg/mL(液相測得)上柱，pH為9，每個柱子上樣70mL，總堿154mg，進行不同梯度pH9乙醇的洗脫劑洗脫，收集不濃度的洗脫液用液相測總堿，再計算不同梯度組總堿量。數(shù)據(jù)觀察得出第一組的洗脫總堿量高，但從生產(chǎn)工藝簡單角度考慮，工業(yè)蒸發(fā)回收的乙醇-水即可達(dá)到70%～30%的濃度，使之可以循環(huán)利用，既節(jié)約資源又提高效益，故以30%～70%洗脫梯度為最佳。見表7。

表7 不同梯度濃度洗脫液的考察

1.9 樹脂連續(xù)上樣次數(shù)的考察 樣品加氯化鈉1.0 mol/L，濃度為2.20 mg/mL(液相測得)上柱，pH為9，每次柱子上樣70 mL，154 mg，連續(xù)上10次樣，洗脫液pH值為9，用30%～70%乙醇分別用(3倍上樣量)210 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液用液相測總堿量。從樹脂上樣次數(shù)分析，樹脂可以連續(xù)上樣，最少可以連續(xù)10次，直至吸附量降到90%，進行樹脂再生。見表8。

表8 樹脂連續(xù)上樣次數(shù)的考察

1.10 中試放大200倍 分別處理樹脂3 kg，裝入150 cm×1 000 cm層析柱中，分別上超聲乙醇提取濃縮液，經(jīng)過加5%氫氧化鈉pH至9，離心過濾料液10 L，液相測總堿濃度為2.47 mg/mL，用pH9，30%～70%乙醇洗脫劑，梯度洗脫，蠕動泵收集洗脫液，洗脫液收集后用液相測總堿，再將洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得膏狀產(chǎn)品。膏狀產(chǎn)品，分別用液相(溴麝香草酚藍(lán)比色法)測總堿，減重法測水分。見表9。

表9 中試放大200倍

1.11 樹脂再生的考察 95%乙醇洗脫至無色，再用2%鹽酸浸泡3小時，用水洗至中性，再用2%氫氧化鈉浸泡3小時，用水洗至中性，吸附效果同新處理樹脂。

2 結(jié)果

pH值為9，且濃度為2.0～2.5 mg/mL(5種堿計)的料液，抽濾加氯化鈉(1.0 mol/L)，以樹脂重量與樣品的體積比為1∶3上柱，用3倍樣品體積30%乙醇(pH=9)先洗脫，再用3倍樣品體積70%乙醇(pH=9)洗脫。按此條件純化，苦豆堿提取率在97%以上，終產(chǎn)品總生物堿純度可達(dá)60%以上。

3 討論

有機溶劑提取分離技術(shù)是天然產(chǎn)物分離的經(jīng)典技術(shù)，由于苦豆子生物堿特別是生物堿的氮氧化物水溶性較大，很難萃取完全，加上界面時有乳化等因素導(dǎo)致萃取效率較低，生物堿的得率低，尤其是常使用有機溶媒為氯仿、甲醇、甲苯對設(shè)備要求高，而且對操作者、環(huán)境有一定危害，產(chǎn)品殘存有劑溶媒，一般僅適用于實驗室小量樣品的制備，而不宜用于工業(yè)生產(chǎn)［1-3］。

離子交換法用離子交換樹脂提取恰好可解決萃取的這些問題，有機溶媒用量少，但本實驗中的苦參類生物堿與離子交換樹脂鍵合力太強［4-8］，用大量的堿性(pH9)乙醇-(70B30)長時間洗脫，生物堿也不能完全洗出，樹脂的再生利用也困難，主要生物堿的損失較大，生物堿的得率也低。

大孔樹脂具有的吸附能力強，預(yù)處理簡單，容易洗脫，機械強度大，容易再生，使用壽命長，液體流動阻力低，抗有機污染能力強，規(guī)模放大效應(yīng)好等優(yōu)點。使用的NaOH、HCl和NaCl價廉易得，所產(chǎn)生的廢水既易于中和排放，其中使用的乙醇可收循環(huán)利用，尤其選用的D101大孔樹脂對生物堿吸附速度快、吸附量大，且洗脫既快又徹底，生產(chǎn)周期短，符合當(dāng)前的清潔生產(chǎn)，綠色環(huán)保生產(chǎn)，是一種經(jīng)濟有效的生產(chǎn)方式，是當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)趨勢。

［1］ 崔九成，佟姝麗.氧化苦參堿的提取分離工藝研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，23(5):51-52.

［2］ 秦學(xué)功，元英進.高效薄層色譜分離苦豆子生物堿的體系優(yōu)化［J］.中草藥，2002，33(6):513.

［3］ 孔令明.苦參總堿提取及其中苦參堿、氧化苦參堿分離、純化的研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［4］ 郭安.苦參總堿和氧化苦參堿提取純化工藝［D］.昆明：西南林學(xué)院，2005.

［5］ 仝燕，王錦玉，張鍇鑌，等.苦參堿提取純化工藝研究［J］.中國方劑學(xué)雜志，2007，13(1)：19-22.

［6］ 李永春.苦豆子生物堿提取與分離純化技術(shù)研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［7］ 秦學(xué)功，元英進.用大孔樹脂吸附吸附分離苦豆子生物堿［J］.中國中藥雜志2007，27(6):428-429.

［8］ 秦學(xué)功.苦豆子生物堿分離純化與生物活性研究［D］.天津:天津大學(xué)，2002.

Study on the Separation and Purification of Total Alkaloids from the Seeds of KuDouZi

GUO Hongyan1,2,LENG Xiaohong1,2,CHEN Haiyan1,2,HAO Caiqin1,2
1 Ningxia Polytechnic,Yinchuan 750021,China;
2 Ningxia Engineering Research Center of Chinese Medicine Development and Utilization

Objective:To increase the purity of alkaloids by applying macroporous resin to total alkaloids from the extract of KuDouZi(Sophora alopecuroides L)seeds.Methods:Feed liquid,scaling pH=9,in the concentrations of 2.0 and 2.5 mg/mL,leaching and adding sodium chloride (1.0 mol/L),the weight of macroporous resin and the volume of the samples were in the ratio of 1:3 on the column,three times of the volume of the samples,pH=9,were used to elute firstly,and then three times volume of 70%ethanol with pH=9 were used.Conclusion:Non-polar D101 macroporous resin is chosen to separate and purify total alkaloids of the extract of KuDouZi seeds directly,which could make the purity of total alkaloids more than 60%,elution rate higher than 97%and obtaining good separation effects.

the seeds of KuDouZi;macroporous resin;separation and purification

R284.2

A

1004-6852(2015)10-0049-04

2014-12-08

郭鴻雁(1967—)，女，高級工程師。研究方向：生物制藥。