介入栓塞法小型豬急性心肌梗死模型的建立

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介入栓塞法小型豬急性心肌梗死模型的建立

劉興華1，董國(guó)禮2，張小明2，繆南東2，任勇軍2，張軍輝3，曹禮庭3

(1.重慶三峽中心醫(yī)院放射科，重慶萬(wàn)州404000;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川南充637000; 3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院超聲科，四川南充637000)

【摘要】目的:用介入栓塞法建立小型豬的急性心肌梗死模型。方法: 11頭貴州種小型豬，體重30～45 kg。術(shù)前采集血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查(心肌酶譜和肌鈣蛋白等);并行心電圖及超聲心動(dòng)圖檢查。常規(guī)冠狀動(dòng)脈造影后，經(jīng)導(dǎo)管將栓子推送到左冠狀動(dòng)脈前降支或回旋支遠(yuǎn)端進(jìn)行栓塞，復(fù)查造影結(jié)果滿(mǎn)意后結(jié)束手術(shù)操作，并復(fù)查心電圖。術(shù)后24 h采集血液復(fù)查實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，并復(fù)查超聲心動(dòng)圖。術(shù)后5周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行心臟病理組織學(xué)檢查。手術(shù)前后的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及心功能指標(biāo)(射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率)采用配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果: 11頭小型豬中，有8頭成功建立急性心肌梗死模型，建模成功率72％。栓塞前:各項(xiàng)檢查結(jié)果正常。栓塞后:冠狀動(dòng)脈造影檢查栓塞遠(yuǎn)端未見(jiàn)顯影;心電圖出現(xiàn)不同程度的異常改變;實(shí)驗(yàn)室檢查及心功能檢查與術(shù)前比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后病理證實(shí)均有梗塞灶的存在。結(jié)論:介入栓塞法成功率高，簡(jiǎn)單易行，是建立穩(wěn)定心肌梗死模型的較好方式之一。

【關(guān)鍵詞】心肌梗死;栓塞;小型豬

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心肌的缺血性壞死，為在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久的急性缺血所致［1］。由心肌梗死引起的心肌功能失代償是成人心血管疾病中發(fā)病率和死亡率最高的病因之一［2］，冠心病在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家常見(jiàn)，在我國(guó)發(fā)病率雖不如歐美國(guó)家，但近年來(lái)隨著人口老齡化，其發(fā)病亦呈逐年上升趨勢(shì)。有關(guān)心肌梗死的研究備受關(guān)注。心肌梗死的動(dòng)物模型對(duì)臨床研究心肌梗死的病理生理及治療具有重要意義。小型豬的心臟解剖結(jié)構(gòu)、血管分布和心臟/體質(zhì)量比與人的心臟相似，兩者冠脈側(cè)支分布均較少，故成為建立心肌梗死模型的良好選擇。目前心肌梗死的造模方法多采用開(kāi)胸結(jié)扎法和介入栓塞法。本研究擬用介入栓塞法建立小型豬的急性心肌梗死模型，并通過(guò)手術(shù)前后冠狀動(dòng)脈造影、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖、超聲心動(dòng)圖及術(shù)后病理等檢查驗(yàn)證造模是否成功，為下一步干細(xì)胞治療的研究提供可靠的動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物11頭貴州種小型豬，體重30～45 kg，雌雄不拘，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備GE數(shù)字減影血管造影機(jī)(型號(hào): Advantx-Lcv-Plus); Philips Sonos 7500超聲多普勒診斷儀。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥品氯胺酮(2 mL∶0.1 g，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)、安定(2 mL∶10 mg，天津藥業(yè)焦作有限公司)、碘海醇(100 mL∶300 mgI/mL，揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建模方法術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。用氯胺酮12 mg/kg，安定0.2 mg/kg耳后肌內(nèi)注射使動(dòng)物麻醉。動(dòng)物安靜后，將豬呈仰臥位固定于檢查床上，用22G留置針建立耳緣靜脈通道，配制氯胺酮500 mg、安定20 mg與500 mL生理鹽水混合液，經(jīng)耳緣靜脈滴注維持麻醉，視麻醉深度調(diào)節(jié)靜滴速度。于心前區(qū)及雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮，心前區(qū)貼電極片后接心電監(jiān)護(hù)儀，腹股溝區(qū)以碘伏消毒后鋪無(wú)菌單。用橈動(dòng)脈穿刺針穿刺右側(cè)股動(dòng)脈，置入5F動(dòng)脈鞘，在導(dǎo)絲引導(dǎo)下，插入左冠導(dǎo)管超選行左冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)后插入3F微導(dǎo)管，于左冠狀動(dòng)脈回旋支或前降支遠(yuǎn)端造影并證實(shí)，透視下緩慢推入3根1 cm長(zhǎng)的4＇絲線(xiàn)線(xiàn)段。栓塞后心電圖示有心肌缺血或梗死改變(T波倒置、ST段抬高，R波波幅降低等)?；赝宋?dǎo)管于左冠狀動(dòng)脈口進(jìn)行造影，證實(shí)回旋支或前降支遠(yuǎn)端閉塞，拔出微導(dǎo)管及左冠狀導(dǎo)管，加壓包扎30 min，觀察穿刺點(diǎn)無(wú)血腫及出血后，放入籠中單獨(dú)喂養(yǎng)。術(shù)前2 d及術(shù)后1周用抗生素預(yù)防感染。

1.2.2冠狀動(dòng)脈造影觀察小豬栓塞前冠狀動(dòng)脈主干及分支是否通暢，管腔有無(wú)異常擴(kuò)張或狹窄，心臟搏動(dòng)有無(wú)異常;栓塞后觀察栓塞部位遠(yuǎn)端血管顯影情況，遠(yuǎn)端血管有無(wú)再通，心臟有無(wú)異常搏動(dòng)。

1.2.3心電圖檢查觀察術(shù)前及術(shù)后心電監(jiān)護(hù)儀顯示的心電圖QRS波波形變化、峰值大小、時(shí)間長(zhǎng)短、心率等。

1.2.4實(shí)驗(yàn)室檢查術(shù)前及術(shù)后24 h，分別抽血行心肌酶譜(門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST;乳酸脫氫酶LDH;肌酸激酶CK;羥丁酸脫氫酶HBDH;肌酸激酶-MB活性CK-MB)和心肌肌鈣蛋白-l(Tnl-ADV)檢查。抽血前進(jìn)行肌注麻醉，劑量同前。

1.2.5超聲心動(dòng)圖檢查建模前后，采用常規(guī)超聲技術(shù)觀察室壁回聲，左室前間隔、下側(cè)壁基底段及中間段收縮期厚度、舒張期厚度、運(yùn)動(dòng)幅度及左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.2.6病理組織學(xué)檢查術(shù)后5周處死動(dòng)物，取出心臟。以1頭正常小豬的心臟作病理對(duì)照。術(shù)后第2天死亡的小豬心臟亦取出做病理檢查。肉眼觀察:心臟解剖形態(tài)、梗死灶大體位置、范圍、顏色等，心腔有無(wú)擴(kuò)大，室壁有無(wú)變薄，有無(wú)附壁血栓，觀察栓子位置。用1∶10甲醛液固定48 h，于左室梗死區(qū)、梗死邊緣及正常組織區(qū)域分別取材，HE染色后制成石蠟切片。鏡下觀察:心肌細(xì)胞及細(xì)胞核的大小、形態(tài)、色澤，梗死周?chē)袩o(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、有無(wú)纖維組織和/或瘢痕形成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

未穿刺成功的、術(shù)中及術(shù)后第2天死亡的小豬不納入統(tǒng)計(jì)計(jì)算。栓塞前及栓塞后24 h血液的心肌酶譜和肌鈣蛋白運(yùn)用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建模前后的心功能(取射血分?jǐn)?shù)，短軸縮短率)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)軟件運(yùn)用SPSS13.0。

2　結(jié)果

2.1建模結(jié)果與冠狀動(dòng)脈造影

11頭行介入栓塞的小豬，其中1頭因股動(dòng)脈痙攣未穿刺成功，1頭在手術(shù)過(guò)程中因肝素化程度不夠?qū)е麓竺娣e心肌梗死，發(fā)生室顫而死亡，1頭于術(shù)后第2天死亡。其余8頭存活到術(shù)后第5周。存活到術(shù)后第5周的8頭小豬術(shù)前冠脈造影:左冠狀動(dòng)脈主干及各級(jí)分支血管通暢，未見(jiàn)異常狹窄及擴(kuò)張(圖1A);術(shù)后:所有小豬冠脈栓塞部位遠(yuǎn)端血管未見(jiàn)顯影，無(wú)再通，提示栓塞成功(圖1B)。

2.2術(shù)前及術(shù)后心電圖表現(xiàn)

存活到術(shù)后第5周的8頭小豬在栓塞前心電圖未見(jiàn)異常(圖2A)，栓塞后5～10 min，在Ⅴ1導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)不同程度的ST段抬高、R波波幅降低，3例在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ1導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)室性早搏(圖2B)。

2.3實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

存活到術(shù)后第5周的8頭小豬術(shù)前及術(shù)后24 h心肌酶譜及肌鈣蛋白結(jié)果對(duì)照見(jiàn)表1，術(shù)后24 h的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)與術(shù)前比較，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　冠狀動(dòng)脈造影表現(xiàn)

圖2　心電圖表現(xiàn)

表1　小豬術(shù)前與術(shù)后24 h實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果對(duì)比

2.4超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果

存活到術(shù)后5周的8頭小豬于術(shù)前、術(shù)后均行超聲心動(dòng)圖檢查。建模前，左室壁各節(jié)段厚度較均勻，未見(jiàn)局限性異常變薄或增厚，收縮期、舒張期波幅較一致，各節(jié)段回聲均勻(圖3A);建模后，所有病例(8/8)梗死節(jié)段變薄，波幅減弱，梗死節(jié)段回聲局限性減弱(圖3B)。射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS)梗死后較梗死前均減小，梗死前后射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率比較見(jiàn)表2。術(shù)后24 h EF及FS與術(shù)前比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3　超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)

表2　建模前與建模后24 h心功能比較

2.5病理結(jié)果

2.5.1小豬正常心臟觀察心臟大小、形態(tài)未見(jiàn)異常，色澤鮮紅，心臟表面無(wú)瘢痕，冠狀動(dòng)脈走行清楚。鏡下:心肌組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞形態(tài)、大小未見(jiàn)異常，胞核無(wú)固縮及溶解，間質(zhì)內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，冠脈內(nèi)未見(jiàn)血栓及栓子(圖4A)。

2.5.2術(shù)后第2天死亡小豬心臟觀察心臟大體形態(tài)未見(jiàn)異常。鏡下:梗死區(qū)心肌細(xì)胞胞核溶解、消失，胞漿均質(zhì)紅染，間質(zhì)水腫，血管擴(kuò)張充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4B)。

2.5.3心肌梗死模型心臟大體觀察栓塞左前降支遠(yuǎn)端的心臟于左室前壁、前間隔或心尖部，栓塞回旋支的心臟于左室側(cè)壁、后壁或下壁見(jiàn)蒼白色梗死灶，因纖維組織增生瘢痕形成，局部凹陷，邊緣不整齊。垂直于心尖與心底連線(xiàn)作連續(xù)橫切斷面，在梗死灶近端冠脈內(nèi)見(jiàn)藍(lán)色線(xiàn)頭(圖5)。鏡下:所有梗死區(qū)大量纖維組織增生，瘢痕形成，在線(xiàn)頭周?chē)?jiàn)肉芽腫性炎癥(圖4C)。

通過(guò)上述手術(shù)前后冠狀動(dòng)脈造影、心電圖檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、超聲心動(dòng)圖檢查及術(shù)后病理檢查證實(shí)，存活到術(shù)后第5周的8頭小豬均成功建立起心肌梗死模型，建模成功率約72％。

圖4　小豬心臟病理圖

圖5　在梗死灶近端冠脈內(nèi)見(jiàn)藍(lán)色線(xiàn)頭

3　討論

3.1動(dòng)物模型的選擇

建立心肌梗死常用的動(dòng)物模型有:鼠［3］、兔［4］、犬［5］、小型豬［6-13］等。鼠和兔的價(jià)格便宜、體型小而方便操作，容易控制較一致的品系，適用于發(fā)病機(jī)理和治療方面的研究，但其體型太小而不宜對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控和檢查，如做MRI檢查要專(zhuān)用的小動(dòng)物線(xiàn)圈，無(wú)疑增大了實(shí)驗(yàn)成本，并且心臟/體質(zhì)量比與人心臟有較大差異。犬的心臟側(cè)支循環(huán)豐富，不易形成穩(wěn)定的梗死灶，不利于對(duì)梗死范圍及藥物療效做出評(píng)價(jià)。小型豬心臟的解剖結(jié)構(gòu)、血管分布和心臟/體質(zhì)量比與人的心臟相近，兩者冠脈側(cè)支分布均較少，容易形成較穩(wěn)定的心肌梗死模型。因此，本研究用小型豬作為建立心肌梗死的模型。

3.2建模方法

建立心肌梗死動(dòng)物模型的方法有:開(kāi)胸結(jié)扎法［8，13］、介入栓塞法［6，7，9-11］、冷凍法［14］、藥物法及Ameriod法等。目前較常用的為開(kāi)胸結(jié)扎法和介入法，開(kāi)胸結(jié)扎法定位雖然準(zhǔn)確，但需要開(kāi)胸，創(chuàng)傷較大、術(shù)后飼養(yǎng)困難、易感染和死亡。介入栓塞法的優(yōu)點(diǎn)有: (1)臨床廢棄的導(dǎo)管、導(dǎo)絲和球囊可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，降低了實(shí)驗(yàn)成本; (2)能夠較精確的定位目標(biāo)血管; (3)梗死機(jī)制與臨床病理機(jī)制相似; (4)手術(shù)創(chuàng)傷小，不需開(kāi)胸，有利于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾因素小; (5)術(shù)后動(dòng)物飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，容易成活。缺點(diǎn)是:建模要在數(shù)字減影血管機(jī)上進(jìn)行，操作者在操作過(guò)程中不可避免受到輻射，這就要求操作者操作要盡可能熟練，盡量減少輻射劑量。本研究采用介入栓塞法建立心梗模型，11頭小型豬，1頭穿刺失敗，1頭術(shù)中死亡，1頭于術(shù)后第2天死亡，建模成功率為72％。

3.3如何提高建模成功率

結(jié)合本研究，筆者總結(jié)用介入栓塞法建立小型豬急性心肌梗死模型應(yīng)注意以下問(wèn)題，以提高建模成功率: (1)小型豬的體重要控制在適當(dāng)?shù)姆秶?，?0～40 kg為宜。體重過(guò)輕，因股動(dòng)脈太細(xì)增加了穿刺難度，穿刺時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)疑增加了操作者輻射劑量;體重過(guò)重，動(dòng)物的搬運(yùn)和檢查比較困難。(2)動(dòng)物的麻醉是手術(shù)成敗的關(guān)鍵，所以在手術(shù)過(guò)程中應(yīng)注意麻醉深度。在穿刺成功前，麻醉不宜過(guò)深，過(guò)深會(huì)導(dǎo)致血壓下降，血管收縮，這時(shí)可以肌注阿托品升高血壓，心率以在100次/min左右為宜。穿刺成功后，可以適當(dāng)加深麻醉，以避免動(dòng)物在操作過(guò)程中躁動(dòng)而增加創(chuàng)傷。(3)一般情況下，經(jīng)皮股動(dòng)脈穿刺即能穿刺成功，但個(gè)別動(dòng)物因皮下脂肪層太厚，尋找股動(dòng)脈比較困難，可以通過(guò)切開(kāi)皮膚及皮下組織，鈍性分離出股動(dòng)脈，提高造模的成功率。(4)在介入的過(guò)程中，要注意使血液肝素化，以免因血液的凝固性過(guò)高導(dǎo)致大量血栓形成，引發(fā)大面積心肌梗死。本研究在建模過(guò)程中一例因急性大面積心肌梗死引起室顫，最終動(dòng)物死亡。(5)栓塞的部位以左前降支或回旋支遠(yuǎn)端1/3為宜，栓塞位置過(guò)高可導(dǎo)致栓塞面積過(guò)大而引起生命危險(xiǎn)。(6)在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，要密切注意動(dòng)物生命體征變化，備齊急救藥品以對(duì)手術(shù)過(guò)程中出現(xiàn)的危急情況做出及時(shí)處理。(7)介入手術(shù)結(jié)束，拔出動(dòng)脈鞘后要壓迫止血，壓迫時(shí)間以30 min為宜，壓迫時(shí)間過(guò)短可能造成穿刺點(diǎn)繼續(xù)出血、血腫形成。(8)手術(shù)前后要合理應(yīng)用抗生素預(yù)防感染。

總之，用介入栓塞法建立小型豬急性心肌梗死模型，動(dòng)物創(chuàng)傷較小，術(shù)后護(hù)理及飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，建模成功率較高，能為后期的干細(xì)胞治療提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型，故逐漸被更多的實(shí)驗(yàn)者采用。

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(學(xué)術(shù)編輯:楊林)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-3-5 12∶47網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.012.html

Establishment of acute myocardial infarction model by interventional embolization in mini-pigs

LIU Xing-hua1，2，DONG Guo-li2，ZHANG Xiao-ming2，MIAO Nan-dong2，REN Yong-jun2，ZHANG Jun-hui3，CAO Li-ting3

(1.Department of Radiology，Chongqing Sanxia Central Hospital，Wanzhou 404000，Chongqing; 2.Department of Radiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan;3.Department of Ultrasonography，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To establish acute myocardial infarction models by interventional embolization in mini-pigs.Methods: E-leven mini-pigs，weighting 30-45kg，were anaesthetized.Echocardiography and electrocardiogram examination as well as coronary artery digital subtraction angiography (DSA)were performed，and myocardial enzymes and troponin were tested before embolization.The distal of left descending artery or left circumflex artery was embolized with sterilized thread segment.In the 11 pigs，embolization was followed by the DSA procedure and electrocardiogram examination.Myocardial enzymes and troponin were tested and echocardiography was performed 24 hours after embolization，and pathologic histology was examined 5 weeks after embolization.Paired t-tests were used in the index of laboratory test and heart function before and after the operation.Results: The model of myocardial infarction was successfully established in 8 of 11 mini-pigs.The successful rate was 72％.All of the results were normal before embolization.After embolization，the coronary artery DSA showed that the object vessels were obstructed.The electrocardiogram examination showed abnormal changes in different degrees.The value of myocardial enzymes，troponin，ejection fraction and fractional shortening were significantly different between preoperative and postoperative examination (P＜0.05).The infarction sites were confirmed by pathologic histology after the operation.Conclusion: The technique of interventional embolization is simple and accessible，and has high successful rate.It is one of the bestbook=52,ebook=57methods to establish stable myocardial infarction models.

【Key words】Myocardial infarction; Embolization; Mini-pigs

通訊作者:董國(guó)禮，E-mail: guoli_d@163.com

作者簡(jiǎn)介:劉興華(1979-)，男，重慶萬(wàn)州人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事醫(yī)學(xué)影像診斷工作。

基金項(xiàng)目:四川省科技廳項(xiàng)目(05JY029-014-1)

收稿日期:2014-05-05

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.12

【文章編號(hào)】1005-3697(2015)01-0051-05

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A