血清堿性磷酸酶測(cè)定結(jié)果的溯源性研究

王衛(wèi)兵

首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069

血清堿性磷酸酶測(cè)定結(jié)果的溯源性研究

王衛(wèi)兵

首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069

一項(xiàng)血清酶測(cè)定結(jié)果的可溯源性研究發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶（ALP）在多種生化分析儀上的測(cè)定結(jié)果與校正物的定值相差懸殊，并且不同來(lái)源的ALP試劑盒的測(cè)定結(jié)果間也存在高低不一的系統(tǒng)誤差。本文分析了系統(tǒng)誤差的產(chǎn)生原因，從理論和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面排除了生化分析儀的原因，指出影響ALP測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素是緩沖液的種類，并以此為例說(shuō)明在進(jìn)行血清酶活性測(cè)定結(jié)果的溯源、校正和室間比對(duì)時(shí)，必須考慮構(gòu)成檢測(cè)系統(tǒng)的各個(gè)要素，包括試劑盒的性能質(zhì)量和生化分析儀的參數(shù)設(shè)置。

堿性磷酸酶；生化分析儀；酶活性測(cè)定；結(jié)果溯源；室間質(zhì)評(píng)

0 前言

在一項(xiàng)血清酶測(cè)定結(jié)果可溯源性研究[1]中，研究的組織者在某市三級(jí)醫(yī)院的50家檢驗(yàn)科和其他臨床實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一發(fā)放了由日本臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（JSCC）推薦的酶參考物（ERM）1支（日本旭化成株式會(huì)社生產(chǎn)），隨后讓各實(shí)驗(yàn)室在多種生化分析義上（主要包括日立、奧林巴斯和貝克曼全自動(dòng)生化分析儀）按現(xiàn)行操作規(guī)程要求進(jìn)行定標(biāo)和室內(nèi)質(zhì)控測(cè)定，之后再測(cè)定ERM，重復(fù)測(cè)定10次，在指定日期內(nèi)完成檢測(cè)，取均值上報(bào)給檢驗(yàn)中心進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。研究者對(duì)50家實(shí)驗(yàn)室的ERM測(cè)定結(jié)果均值與ERM標(biāo)示值進(jìn)行了比較，認(rèn)為二者間的相對(duì)偏倚屬于系統(tǒng)誤差，其中相對(duì)偏倚最大的項(xiàng)目是堿性磷酸酶（ALP）。研究者對(duì)此指出，ALP測(cè)定結(jié)果顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示值，不同試劑間的測(cè)定結(jié)果偏差較大，這與試劑中緩沖液的組成和種類有關(guān)，未明確ALP測(cè)定結(jié)果偏差的原因。筆者查對(duì)了該研究論文中列出的11個(gè)不同來(lái)源的ALP試劑盒的測(cè)定原理和試劑組成，現(xiàn)就ALP測(cè)定結(jié)果的溯源、校正和室間質(zhì)評(píng)與試劑盒性能質(zhì)量的關(guān)系討論如下。

1 ALP測(cè)定結(jié)果在EAE和2A 2M 1P緩沖系統(tǒng)間的系統(tǒng)誤差的原因分析

在筆者査對(duì)的11種試劑盒中，有8個(gè)試劑盒的測(cè)定結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示值，這些試劑盒使用的底物相同，均為對(duì)硝基酚磷酸二鈉，緩沖系統(tǒng)為2-氨基-2-甲基-1-丙醇（2A2M 1P）。不同ALP試劑盒選用的2A2M 1P濃度范圍為0.35～1.00 mol/L，pH范圍為10.2～10.9，ALP激活劑Mg2+濃度范圍為0.5～2.2 mmol/L（其中有用醋酸鎂的，也有用氧化鎂的），這8種試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果比標(biāo)示值低的程度范圍為30％～50％，不同試劑盒間的差異應(yīng)該是由2A2M 1P緩沖液濃度、pH值和Mg2+濃度的差異造成的。如果檢測(cè)的酶標(biāo)準(zhǔn)品是在2A2M 1P緩沖系統(tǒng)內(nèi)定值，那么這8種試劑盒的測(cè)定結(jié)果應(yīng)該最接近定值。在室間質(zhì)評(píng)的ALP測(cè)定方法分組時(shí)，此8種試劑盒應(yīng)歸為一組，使用同一靶值，計(jì)算變異指數(shù)（VIS）和能力比對(duì)（PT）得分。那么為什么采用這8種ALP試劑盒檢測(cè)ERM的ALP活性會(huì)出現(xiàn)如此大的負(fù)偏倚呢？

筆者查閱了ERM中，ALP并不是在2A2M 1P緩沖液內(nèi)定值，而是采用日本臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（JSCC）的推薦方法定值[2]，緩沖液是2-乙基氨基乙醇（EAE），而美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（AACC）和國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）推薦方法中采用的緩沖液為2A2M 1P[3]，德國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)[4]（GSCC）和斯堪地那維亞臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（SSCC）則推薦使用二乙醇胺（DEA）。在不同緩沖系統(tǒng)中，血清中ALP各型同工酶活性的表達(dá)程度不一。而在EAE中，ALP各型同工酶相對(duì)催化反應(yīng)性較一致，即肝型100％、骨型90％、胎盤型89％、小腸型99％。而在DEA或2A2M 1P中，小腸型ALP的相對(duì)活性表達(dá)低于50％，在一些肝病血清中小腸型ALP也占相當(dāng)大比例，故我國(guó)和JSCC推薦使用EAE作為緩沖液[5]。JSCC曾在EAE與DEA緩沖液系統(tǒng)中測(cè)定了一批血清的ALP活性，觀察了肝型、小腸型ALP在兩種緩沖系統(tǒng)中的活性表達(dá)（圖1）。由圖1可見(jiàn)，小腸型ALP在EAE中的活性比在DEA中高出約33％[6]。

圖1 兩種緩沖液（DEA和EAE）中ALP活性相關(guān)散點(diǎn)圖

筆者在一項(xiàng)比較研究中，用3種緩沖液系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)了高ALP活性血清的系列稀釋樣品，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，ALP活性在DEA中比在2A2M 1P中平均高出2倍以上；ALP活性在2A2M 1P中又比在碳酸鹽緩沖液高。在本研究納入的20例患者中，在DEA（Y）與碳酸鹽緩沖液（X）中測(cè)定血清ALP活性的相關(guān)系數(shù)（r）為0.99，回歸方程Y＝2.46X-5.99，回歸散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3。分別以ALPEAE、ALPDEA、ALP2A2M 1P、ALPNaHCO3/Na2CO3代表4種緩沖液的ALP活性。若根據(jù)圖1～3的數(shù)據(jù)測(cè)定同一樣品的ALP活性，應(yīng)呈現(xiàn)ALPEAE≈ALPDEA＞ALP2A2M 1P＞ALP NaHCO3/Na2CO3，這正是采用2A2M 1P緩沖液的8個(gè)不同來(lái)源的ALP試劑盒檢測(cè)ERM的ALP活性會(huì)出現(xiàn)較大負(fù)偏倚的原因。按照酶校正物可轉(zhuǎn)移性（Transferability）的定義，酶校正物只能在兩個(gè)表現(xiàn)有相同分析特異性的方法間轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性，因此由JSCC法定值的ERM不適合在以2A2M 1P為緩沖液的ALP測(cè)定方法中轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確性。

圖2 堿性磷酸酶活性與緩沖液種類的關(guān)系

圖3 兩種緩沖液中血清堿性磷酸酶活性相關(guān)散點(diǎn)圖

2 ALP測(cè)定結(jié)果在EAE和DEA緩沖系統(tǒng)間的系統(tǒng)誤差的原因分析

由上所述，由JSCC法定值的ERM也不適合在以DEA為緩沖液的ALP測(cè)定方法中進(jìn)行校正。由圖1可知，EAE和DEA分析特異性的不同主要表現(xiàn)在小腸型ALP在EAE中表達(dá)程度為99％，而在DEA中卻不足50％。IFCC和我國(guó)臨床檢驗(yàn)學(xué)會(huì)否定DEA緩沖系統(tǒng)的原因有5點(diǎn)[5]：①DEA的pH反應(yīng)曲線為過(guò)敏感曲線，對(duì)保證分析的重復(fù)性不利；②1 mol/L的DEA粘度大，在儀器分析中易產(chǎn)生交叉污染；③DEA的pH離最適pH較遠(yuǎn)；④DEA試劑雜質(zhì)中有ALP抑制劑；⑤不同型ALP同工酶活性表達(dá)差異相對(duì)較大。GSCC和SSCC主要依據(jù)緩沖液選擇的一般原則，即從多種緩沖液中選擇酶活性表達(dá)最高者，至于其他一些弱點(diǎn)可以用提高試劑純度、降低濃度等加以調(diào)整。

在11種檢測(cè)ERM的ALP試劑盒中，有兩種ALP試劑盒的檢測(cè)結(jié)果高于ERM的標(biāo)示值，其中一種ALPDEA1的正偏倚約25％，另一種ALPDEA2的正偏倚竟高達(dá)80％，這兩種ALP試劑盒都為德國(guó)生產(chǎn)。經(jīng)查產(chǎn)品說(shuō)明書已明確ALPDEA2所用緩沖液是DEA，濃度0.35 mol/L，pH10.4，醋酸鎂16 mmol/L，ZnSO41.0 mmol/L，其中Mg2+濃度比上述任一ALP試劑盒中的Mg2+濃度都高，而且添加了Zn2+，這可能是ALPDEA2測(cè)定結(jié)果比ERM標(biāo)示值高出80％的主要原因。Mg2+是ALP的激活劑，而血清內(nèi)源性Mg2+濃度會(huì)因人而異，正常成人血清Mg2+濃度的參考范圍為0.74～1.03 mmol/L。Zn2+又是ALP的輔基，Zn2+-ALP為全酶（holo-ALP）具有活性，如失去Zn2+只剩下ALP的酶蛋白（apo-ALP）則無(wú)活性?？紤]到大多數(shù)定值或非定值質(zhì)控血清，甚至酶校正物在制備過(guò)程中會(huì)發(fā)生Zn2+丟失，在這些質(zhì)控物質(zhì)或校正物中就會(huì)存在不同比例的apo-ALP。依據(jù)上述結(jié)果，日本旭化成株式會(huì)社的ERM中必然存在較高比例的apo-ALP，因此在使用含有Zn2+的ALPDEA2試劑盒測(cè)定時(shí)，這些apo-ALP可得以表達(dá)。據(jù)此也可推斷，日本旭化成株式會(huì)社在給ERM定值的ALP試劑組分中缺Zn2+，沒(méi)有使apo-ALP轉(zhuǎn)化為holo-ALP。

據(jù)IFCC的ALP研究資料顯示，在ALPDEA2的試劑中，除有Zn2+外，還應(yīng)有適量離子緩沖螯合劑N-羥基乙基乙二胺四乙酸（HEDTA）。這是因?yàn)椋篫n2+/Mg2+之間存在對(duì)apo-ALP的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，如果反應(yīng)液中Zn2+/Mg2+比例不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致ALP活性下降；因?yàn)閆n2+對(duì)apo-ALP的親和力比Mg2+高10倍，為防止Zn2+對(duì)Mg2+激活作用的解除，需要向試劑中添加適量HEDTA，利用Zn2+-HEDTA與Mg2+-HEDTA解離常數(shù)的不同，維持反應(yīng)液Zn2+/Mg2+的適當(dāng)比例，以實(shí)現(xiàn)ALP的最大活性表達(dá)。ALPDEA1測(cè)定結(jié)果不如ALPDEA2高的原因，即與Mg2+、Zn2+、HEDTA等在試劑盒生產(chǎn)中的運(yùn)用是否科學(xué)合理有關(guān)[7]。

3 由ALP室間質(zhì)評(píng)分析科學(xué)分組的重要性

在ALP室間質(zhì)評(píng)中，底物相同都是對(duì)硝基酚磷酸鹽（4NPP），方法學(xué)分組應(yīng)當(dāng)主要依據(jù)采用何種緩沖體系。在RANDOX組織的－次跨國(guó)室間質(zhì)評(píng)中，涉及1000多個(gè)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室，主要分為兩組：（4NPP，AMP，37℃）和（4NPP，DEA，37℃），兩組的回報(bào)結(jié)果（均值±2SD）確定的靶值分別是409 U/L和505 U/L（表1），可見(jiàn)方法組1（AMP）緩沖液與方法組2（DEA）緩沖液間的質(zhì)評(píng)結(jié)果存在明顯系統(tǒng)誤差。

表1 RANDOX室間質(zhì)評(píng)ALP回報(bào)數(shù)據(jù)分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果

某國(guó)家在2007年組織了3次共15個(gè)調(diào)查樣品的室間質(zhì)評(píng)，選擇其中一組數(shù)據(jù)（200721）來(lái)顯示兩個(gè)方法組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2），可見(jiàn)方法組1（AMP）緩沖液與方法組2（其他）緩沖液的質(zhì)評(píng)結(jié)果均值基本相等。這種回報(bào)結(jié)果趨同性是由于方法學(xué)分組不科學(xué)，再加上其他原因造成的，使本應(yīng)存在的方法間的系統(tǒng)誤差不能顯現(xiàn)。

表2 某國(guó)家室間質(zhì)評(píng)ALP回報(bào)數(shù)據(jù)分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果

此外，ALP測(cè)定時(shí)如果不按所用緩沖系統(tǒng)進(jìn)行分組，而是使用同一靶值，將使室間質(zhì)評(píng)結(jié)果混亂，達(dá)不到通過(guò)參加室間質(zhì)評(píng)來(lái)提高參評(píng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)準(zhǔn)確性的目的。某國(guó)家某省在2006年進(jìn)行的室間質(zhì)評(píng)沒(méi)有分組，ALP回報(bào)結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)在ALP室間質(zhì)評(píng)中，不進(jìn)行科學(xué)合理的方法學(xué)分組，必然會(huì)導(dǎo)致這種高低相差懸殊的回報(bào)結(jié)果。

表3 某國(guó)家某省2006年室間質(zhì)評(píng)ALP回報(bào)結(jié)果

4 ALP檢測(cè)系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)誤差

試劑盒的性能質(zhì)量會(huì)影響ALP的測(cè)定結(jié)果，除緩沖液外，其他因素如底物濃度、pH、離子強(qiáng)度、輔因子的種類和濃度等也會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。此外，校正方法、儀器性能、儀器分析中的參數(shù)設(shè)置、儀器維護(hù)保養(yǎng)及操作規(guī)程等也會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成影響，即凡是構(gòu)成“ALP檢測(cè)系統(tǒng)”的各要素在任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都會(huì)影響到最終結(jié)果。

以某公司生產(chǎn)的ALP試劑盒為例，其緩沖液為2A2M 1P，參數(shù)設(shè)置為波長(zhǎng)405 nm、比色杯光徑1 cm、反應(yīng)溫度37 ℃。第1種測(cè)定方法以血清起動(dòng)：應(yīng)用試劑為試劑1與試劑2以4：1比例混合后備用，應(yīng)用試劑與標(biāo)本按1000 μL比20 μL的比例混勻，60 s后開(kāi)始監(jiān)測(cè)2 m in內(nèi)每分鐘的吸光度變化，并計(jì)算出每分鐘吸光度的變化率；第2種測(cè)定方法以試劑2起動(dòng)：試劑1與標(biāo)本按800 μL比20 μL的比例混勻并保溫3～5 min，加入200μL試劑2混勻，60 s后開(kāi)始監(jiān)測(cè)2 m in內(nèi)每分鐘的吸光度變化，并計(jì)算出每分鐘吸光度的變化率，根據(jù)每分鐘吸光度的變化率計(jì)算ALP的活性。從上述過(guò)程可以看出，“ALP檢測(cè)系統(tǒng)”包含多種影響因素，在分析時(shí)需要具體分析和綜合分析相結(jié)合。在“ALP檢測(cè)系統(tǒng)”間，影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素是緩沖液種類和試劑配方。另一項(xiàng)關(guān)于不同檢測(cè)系統(tǒng)血清酶測(cè)定結(jié)果的偏倚評(píng)估與可比性的研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)系統(tǒng)與目標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)間的誤差不能被接受，其原因也應(yīng)按上述思路進(jìn)行分析[8]。

為了做好血清酶測(cè)定結(jié)果的溯源、校正和室間質(zhì)評(píng)，相關(guān)人員應(yīng)進(jìn)一步學(xué)習(xí)IFCC發(fā)布的文件[PⅡS0009-9120（98）00039-3]，該文件以實(shí)例證明了酶校正物的可交換性只能在有相同分析特異性的方法間進(jìn)行，并一再?gòu)?qiáng)調(diào)了“檢測(cè)系統(tǒng)”的概念。不能把酶校正物簡(jiǎn)單地當(dāng)作一般代謝物已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品那樣使用，避免造成測(cè)定結(jié)果和臨床應(yīng)用的混亂[9]。正如文獻(xiàn)報(bào)道的那樣：一個(gè)廠家的校正品一般都是在自己的檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行評(píng)估的，在同類系統(tǒng)內(nèi)能很好地把測(cè)定結(jié)果的值在參考方法和常規(guī)方法間進(jìn)行傳遞，但它不一定適合另一個(gè)廠家的檢測(cè)系統(tǒng)，因此不要把一個(gè)廠家針對(duì)特定檢測(cè)系統(tǒng)生產(chǎn)的校正品用于校正另一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)[10]。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，國(guó)際上對(duì)ALP的基因結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)的研究已經(jīng)非常深入，ALP檢測(cè)的參考方法、標(biāo)準(zhǔn)操作程序和參考物質(zhì)（校正血清）也都已經(jīng)推廣，ALP測(cè)定的準(zhǔn)確性也不斷提高。為保證我國(guó)臨床常規(guī)化驗(yàn)室ALP活性測(cè)定及校正的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)溯源式管理，應(yīng)科學(xué)開(kāi)展室間質(zhì)評(píng)，深入開(kāi)展相關(guān)工作。

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Research on the Traceability of the Serum A lkaline Phosphatase Determ ination Results

WANG Wei-bing
Capital M edical University, Beijing 100069, China

An exam ination to the traceability of alkaline phosphatase（ALP）activity discovered that laboratory ALP activity measurement results existed big differences from the fixed value of enzyme reference material, and higher or lower system errors existed between ALP kits from different sources.This review analyzed the reason of these system errors, indicated that the key in fl uencing factor was buffer system type in ALP assay.Taking ALP as an example, it indicated that traceability, calibration and external laboratory quality assessment of serum enzymes activity measurement must consider every element of the detecting system, including performance quality of reagent kit and parameter settings of analyzer.

alkaline phosphatase；biochem ical analyzer；determ ination of the enzyme activity；result traceability；room quality assessment

R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2015.12.013

1674-1633（2015）12-0049-04

2015-04-08

作者郵箱：wanglei@ccmu.edu.cn