黃芪多糖配伍三七總皂苷對糖尿病模型大鼠腎臟保護作用研究

蔣 賽彭曉珊黃志華王碩輝謝 月唐映紅，2

·論 著·

黃芪多糖配伍三七總皂苷對糖尿病模型大鼠腎臟保護作用研究

蔣 賽1彭曉珊1黃志華1王碩輝1謝 月1唐映紅1，2

目的 探討黃芪多糖與三七總皂苷配伍對糖尿病大鼠腎臟功能的保護作用。方法 SPF級SD大鼠60只，10只為正常對照組，50只予腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，將糖尿病模型大鼠隨機分為模型組、黃芪多糖組、三七總皂苷組、黃芪多糖與三七總皂苷配伍組、貝那普利組，每天給相應(yīng)藥物1次，連續(xù)8周。8周后測定各組大鼠24h尿總蛋白、血糖、血肌酐和尿素氮；取腎臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠24h尿總蛋白［（103.76±4.67）mg/24h比（13.82±4.49）mg/24h］、血糖［（28.44±3.74）mmol/L比（6.59±1.11）mmol/h］、血肌酐［（111.91± 9.46）μmol/L比（44.78±4.12）μmol/L］和尿素氮［（10.90±1.76）mmol/h比（5.53±1.27）mmol/L］顯著升高（P<0.01）；病理組織學(xué)檢查可見模型組大鼠腎小球基底膜增厚，腎小管出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠尿蛋白［（84.01±7.20）mg/24h］、血糖［（20.60±2.10）mmol/ L］和肌酐［（80.58±4.52）μmol/L］明顯下降（P<0.05）；三七總皂苷組大鼠血糖［（21.86±4.08）mmol/ L］和肌酐［（77.79±5.59）μmol/L］下降（P<0.05）；黃芪多糖和三七總皂苷配伍組大鼠尿蛋白［（66.00± 3.43）mg/24h］、血糖［（16.34±2.34）mmol/L］、肌酐［（68.94±3.22）μmol/L］和尿素氮［（7.43±1.48）mmol/ L］含量均明顯下降（P<0.01）。各給藥組腎臟病理改變均有不同程度改善。結(jié)論 黃芪多糖與三七總皂苷配伍對糖尿病大鼠的腎臟具有保護作用，其作用優(yōu)于黃芪多糖和三七總皂苷單用組。

大鼠；糖尿病腎病；腎功能；黃芪多糖；三七總皂苷；鏈脲佐菌素

糖尿病病程2年以上，臨床雖無腎病表現(xiàn)，而腎小球基底膜已有增厚；糖尿病10～20年，糖尿病腎病的發(fā)病率為30%～50%，糖尿病腎病患者有66%死于尿毒癥[1]。研究表明，黃芪多糖能有效改善糖尿病腎病患者的臨床癥狀，降低24h尿蛋白，顯著改善腎功能，可降低餐后血糖，改善脂質(zhì)代謝[2-4]。三七總皂苷可降低糖尿病腎病患者尿蛋白、β2-微球蛋白，改善腎功能[5-6]。黃芪多糖和三七總皂苷均可改善糖尿病腎病患者的腎功能，但兩者合用是否產(chǎn)生協(xié)同作用尚未見報道。本研究觀察黃芪多糖配伍三七總皂苷對糖尿病模型大鼠腎臟保護作用，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003。大鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，12h交替光線照明，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫20～25℃，相對濕度40%～50%。

1.2 藥 品 黃芪多糖（批號UD130927，含量：77%，陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司提供）；三七總皂苷[批號130628，含量：93.8%，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司]；鹽酸貝那普利片（批號AE2013 0902，規(guī)格：10mg/片，深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司）。鏈脲佐菌素（STZ）（批號9058035，北京Solarbio科技有限公司）。

1.3 儀器及ONETOUCH 血糖測量儀及血糖試紙:強生公司生產(chǎn)；PUS-2018G半自動生化分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)。總蛋白試劑盒、血糖試劑盒、肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食16h，取50只大鼠予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg（用0.1mol/L、pH4.4檸檬酸緩沖液在冰浴上配制1%STZ），給藥體積為6mL/kg，正常對照組10只則注射等體積的檸檬酸緩沖液。STZ注射72h后，尿糖（+++），血糖高于16.7mmol/L者確定為糖尿病大鼠。將成模大鼠隨機分為模型對照組、黃芪多糖組、三七總皂苷組、黃芪多糖和三七總皂苷配伍組以及貝那普利組，每組10只大鼠。

2.2 給 藥 正常對照組與模型組分別予蒸餾水灌胃；黃芪多糖組給予黃芪多糖300mg（/kg·d）灌胃；三七總皂苷組給予三七總皂苷（100mg（/kg·d）灌胃；配伍組給予黃芪多糖300mg（/kg·d）+三七總皂苷100mg（/kg·d）灌胃；貝那普利組給予貝那普利0.9mg（/kg·d）灌胃，每天給藥1次，給藥體積均為10mL/kg，連續(xù)8周。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測 末次給藥后，收集各組大鼠24h尿液，測定尿量后離心，取上清液檢測尿總蛋白。大鼠稱重后，10%水合氯醛0.35mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血約10mL，分離血清，采用雙縮脲法測定大鼠尿液中總蛋白的含量。采用葡萄糖氧化酶法測定大鼠血清中葡萄糖的含量。采用苦味酸法測定大鼠血清中血肌酐的含量。采用酶偶聯(lián)速率法測定大鼠血清中尿素氮含量。取出雙測腎臟稱重，計算腎臟器系數(shù)。取左腎用pH7.4、10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況 實驗過程中正常對照組和各給藥組均有1只大鼠死亡，模型組實驗過程中死亡3只。正常對照組大鼠精神狀況良好，皮毛有光澤，活動自如，反應(yīng)靈敏；糖尿病模型組大鼠精神逐漸萎靡、明顯消瘦、多尿、多飲、毛色發(fā)黃無光澤，反應(yīng)遲鈍；各給藥組大鼠精神狀況，反應(yīng)靈敏度均比模型組大鼠要好。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量變化和腎臟器系數(shù)比較 與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P<0.01），腎臟臟器系數(shù)明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖組、三七總皂苷組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.05），其腎臟臟器系數(shù)雖然有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，黃芪多糖與三七總皂苷配伍組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.01），腎臟臟器系數(shù)降低（P<0.05），黃芪多糖與三七總皂苷配伍組大鼠體質(zhì)量增加幅度高于黃芪多糖和三七總皂苷單用組（P<0.05），腎臟臟器系數(shù)增加幅度低于黃芪多糖和三七總皂苷單用組（P<0.05），見表1。3.3 各組大鼠24h尿總蛋白含量比較 與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠尿總蛋白明顯增加（P< 0.01）；與模型組比較，黃芪多糖組和三七總皂苷組大鼠尿蛋白含量明顯降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，黃芪多糖、三七總皂苷配伍組大鼠尿蛋白含量明顯降低（P<0.01），黃芪多糖組和三七總皂苷配伍組降低尿蛋白的作用優(yōu)于黃芪多糖組和三七總皂苷組（P<0.05）。配伍組與貝那普利組比較各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與黃芪多糖組比較，▲P<0.05；與三七總皂苷組比較，▽P<0.05

組別正常對照組模型組黃芪多糖組三七總皂苷組配伍組貝那普利組只數(shù)979999體質(zhì)量（g）411.46±37.90 264.15±22.09** 304.8±34.92△296.40±27.04△333.42±20.00△△▲▽335.56±30.48△△▲▽腎臟臟器系數(shù)（mg/g）6.29±0.26 10.97±2.08** 10.20±0.33 10.08±0.42 8.44±0.53△▲▽9.22±0.37△▲▽尿總蛋白（mg/24h）13.82±4.49 103.76±4.67** 84.01±7.20△△96.82±6.87△66.00±3.43△△▲▽65.08±2.60△△▲▽

3.4 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，黃芪多糖組和三七總皂苷組大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量明顯降低（P< 0.05，P<0.01）；與模型組相比，黃芪多糖與三七總皂苷配伍組血糖、肌酐、尿素氮含量明顯降低（P< 0.01）；黃芪多糖與三七總皂苷配伍組降低血糖、肌酐、尿素氮作用優(yōu)于黃芪多糖組與三七總皂苷組（P< 0.05）。見表2。

3.5 腎臟病理組織學(xué)檢查 正常對照組大鼠腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無炎癥和纖維變化；模型組大鼠腎小球體積增大，基膜增厚，球內(nèi)血管縮小甚至閉合，腎小管出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，管型蛋白，間質(zhì)纖維化。各用藥組上述病理改變均有不同程度減輕，而黃芪多糖和三七總皂苷配伍組大鼠腎臟病理改變減輕尤為明顯。見圖1（封二）。

4 討 論

建立糖尿病動物模型的方法有很多，包括胰腺切除術(shù)誘導(dǎo)法、化學(xué)藥物誘導(dǎo)法（如鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等）、拮抗胰島素因子誘導(dǎo)法、食物誘發(fā)及催肥等[7]。其中化學(xué)藥物誘導(dǎo)糖尿病操作簡單，造模時間短，是目前制備糖尿病動物模型的首選方法[8]。目前建立糖尿病大鼠模型普遍使用腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），STZ是一種廣譜抗生素，對實驗動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性破壞作用，減少胰島素合成。腹腔注射STZ可誘導(dǎo)大鼠形成糖尿病，采用腹腔單次注射60mg/kg STZ建立糖尿病大鼠模型，具有建模方法簡便、穩(wěn)定性高、死亡率低，胰島β細(xì)胞損害特異性高等優(yōu)點[9]。STZ可誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)受損，腹腔注射STZ后一定時間大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白明顯升高，病理組織學(xué)檢查可見腎小球明顯增大、腫脹，基底膜增厚，腎小球硬化，腎間質(zhì)纖維化等,因此大鼠腹腔注射STZ可形成糖尿病腎病[10-11]。而腹腔注射STZ 60mg/ kg是致糖尿病SD大鼠發(fā)生腎病的最佳劑量[12]。

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭重要原因。糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球和腎小管肥大，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的大量堆積和腎小球硬化等[11]。高血糖時，氧自由基增加，并造成膜蛋白及脂質(zhì)過氧化，使膜通透性增加，血液中大分子物質(zhì)沉積在基底膜，導(dǎo)致基底膜增厚，損傷腎小球基底膜，導(dǎo)致腎功能障礙[13-14]。

表2 各組血清生化指標(biāo)比較（±s）

表2 各組血清生化指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與黃芪多糖組比較，▲P<0.05；與三七總皂苷組比較，▽P<0.05。APS：黃芪多糖；PNS：三七總皂苷

組別正常對照組模型組黃芪多糖組三七總皂苷組配伍組貝那普利組只數(shù) 劑量（mg/kg）979999 --300 100 APS300、PNS100 0.9血糖（mmol/L）6.59±1.11 28.44±3.74** 20.60±2.10△△21.86±4.08△△16.34±2.34△△▲▽16.18±3.33△△▲▽肌酐（μmol/L）44.78±4.12 111.91±9.46** 80.58±4.52△△77.79±5.59△△68.94±3.22△△▲▽64.32±3.51△△▲▽尿素氮（mmol/L）5.53±1.27 10.90±1.76** 8.81±1.33△8.96±1.30△7.43±1.48△△▽7.39±2.18△△▽

本研究表明，大鼠腹腔注射STZ 60mg/kg后出現(xiàn)精神萎靡、明顯消瘦、多尿、多飲、皮毛無光澤，反應(yīng)遲鈍。8周后糖尿病大鼠尿蛋白排泄增加，血糖、肌酐和尿素氮含量升高；病理組織學(xué)檢查可見大鼠腎小球基底膜增厚，球內(nèi)血管縮小甚至閉合，腎小管出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，管型蛋白，間質(zhì)纖維化。在誘導(dǎo)糖尿病的早期給予黃芪多糖、三七總皂苷治療后，大鼠體質(zhì)量減輕、多飲、多食、多尿等癥狀改善；大鼠24h尿蛋白排泄明顯減少，血肌酐和尿素氮明顯降低，腎臟病理學(xué)損傷明顯減輕，表明黃芪多糖、三七總皂苷可減少尿蛋白的排出，有效防止或延緩糖尿病腎病的病理學(xué)進(jìn)展，對糖尿病所誘導(dǎo)的腎臟損害有一定的保護作用，結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[15-16]。本研究也表明，黃芪多糖和三七總皂苷配伍后降低糖尿病大鼠血糖、減輕腎臟損害，作用優(yōu)于黃芪多糖、三七總皂苷單用組，提示黃芪多糖配伍三七總皂苷可以產(chǎn)生協(xié)同作用，延緩糖尿病大鼠腎病的發(fā)生。

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（收稿：2015-00-00 修回：2015-00-00）

Effect of Astragalus Polysaccharides Combined w ith Panax Notoginseng Saponins on K idney of Rats w ithDiabetic Nephropathy

JIANG Sai1,PENG Xiaoshan1,HUANG Zhihua1,WANG Shuohui1,XIE Yue1,TANG Yinghong1,2. 1 Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2 Key Lab of Modernization of Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

Objective To investigate effect of Astragalus Polysaccharides（APS）combined with Panax Notoginseng saponins（PNS）on kidney of rats with diabetic nephropathy.M ethods Diabetic nephropathy was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin.A total of 50 diabetic rats were randomlydivided into model group,APS group,PNS group,PNS combined with APS group,benazeprilgroup.Rats were administered the corresponding drug intragastrically dailyfor 8 weeks.Urinary protein level in 24h,blood sugar,blood creatinine,and urea nitrogen level and histopathological examination of the kidney were determined.Another 10 rats served as normal control.Results Urinary protein level in 24h,blood glucose,creatinine,and urea nitrogen level in rats in model group were significantly higher than those in normal control group（103.76±4.67mg/24h vs 13.82±4.49mg/24g,28.44±3.74mmol/L vs 6.59±1.11mmol/L,111.91±9.46μmol/L vs 44.78±4.12μmol/L,and 10.90±1.76mmol/h vs 5.53±1.27mmol/L;all P< 0.05）.Histopathological examination showed glomerular basement membrane thickening,a large number of inflammatory cell infiltration into tubular,and interstitial fibrosis.Compared with model group,APS reduced urinary protein to 84.01±7.20mg/24h,blood glucose to 20.60±2.10mmol/L,and creatinine content to 80.58±4.52μmol/L（all P< 0.05）;PNS decreased blood glucose to 21.86±4.08mmol/L and creatinine content to 77.79±5.59μmol/L（all P<0.05）;in compatibility groupurinary protein,blood glucose,creatinine,and urea nitrogen content were further lowedto 66.00±3.43mg/24h,16.34±2.34mmol/L,68.94±3.22μmol/L,and 7.43±1.48mmol/L（all P<0.05）.Renal pathological changes had greatly improved in treatment groups.Conclusion APS combined with PNS haveprotective effect on kidney of rats with diabetic nephropathy,and the effect was better than that ofAPS and PNS alone.

Diabetic nephropathy;Kidney function;Astragalus Polysaccharides;Panax Notoginseng saponins; Streptozotocin

湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目湘教通[2012]（No.402-187）；2012地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（No. 201210541005）

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室（長沙410208）；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化重點實驗室（長沙410208）

唐映紅，Tel：0731-88458238；E-mail：tyhong62@qq.com