發(fā)酵鴨肉腸加工工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

石江濤

摘 要：以鴨腿為原料，選擇嗜酸乳桿菌（L. plantarum）和戊糖片球菌（P. pentosaces）為發(fā)酵菌種，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)方法優(yōu)化發(fā)酵鴨肉腸的加工工藝，并采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)發(fā)酵鴨肉腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成。結(jié)果表明：發(fā)酵鴨肉腸較佳的加工工藝條件為：發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時(shí)間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃，此工藝下制作的發(fā)酵鴨肉腸具有較好的感官品質(zhì)。從發(fā)酵鴨肉腸中檢測(cè)出37種揮發(fā)性成分，包括醛類、醇類、烴類、酸類、酯類以及含氮類化合物等。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵鴨肉腸；加工工藝；響應(yīng)面試驗(yàn)；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；氣質(zhì)聯(lián)用

Abstract： The process optimization using combination of single factor method and response surface methodology （RSM） for the production of fermented duck sausage from duck leg meat using a 1：1 mixture of L. plantarum and P. pentosaces as starter culture was conducted in this study. The response was sensory evaluation score. Volatile compounds in fermented sausage were determined by solid-phase microextraction （SPME） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Results indicated that the optimal processing parameters of fermented duck sausage were 106 CFU/g starter culture， 54 h of fermentation time， and 27 ℃ of fermentation temperature. Totally 37 volatile flavor compounds including aldehydes， alcohols， hydrocarbons， acids， esters and nitrogenous compounds were identified in fermented duck sausage.

Key words： fermented duck sausage； processing technology； response surface methodology （RSM）； volatile flavor； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

中圖分類號(hào)：TS251.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2015）11-0019-05

doi： 10.15922/j.cnki.rlyj.2015.11.005

鴨肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇，富含B族維生素和VE等特點(diǎn)[1-2]，深受消費(fèi)者歡迎。發(fā)酵香腸是指將肉絞碎，添加發(fā)酵劑、輔料等，腌制灌腸，經(jīng)微生物的自然發(fā)酵或者人工發(fā)酵而制成的具有特殊風(fēng)味的肉制品[3-5]。

發(fā)酵香腸加工生產(chǎn)及成熟的過(guò)程中脂肪水解，經(jīng)過(guò)酶和非酶氧化產(chǎn)生直鏈脂肪烴類、醛類、酮類和羧酸等，形成重要的風(fēng)味物質(zhì)[6-7]。同時(shí)微生物酶的存在，蛋白質(zhì)被分解為氨基酸、核苷酸和寡肽等，這些小分子物質(zhì)在改善發(fā)酵香腸的滋味方面發(fā)揮著重要作用[8]。然而，發(fā)酵香腸風(fēng)味物質(zhì)的來(lái)源比較復(fù)雜，發(fā)酵香腸的原輔料、發(fā)酵劑的類型和特性、加工條件這些共同決定著發(fā)酵香腸的風(fēng)味[9-11]。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響香腸風(fēng)味的重要因素，通過(guò)感官評(píng)價(jià)和色譜技術(shù)結(jié)合的方法可對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析[12-13]。目前，關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵香腸（豬肉、牛肉）的揮發(fā)性風(fēng)味研究已有報(bào)道[14-19]，但對(duì)發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)選擇嗜酸乳桿菌

（L. plantarum）和戊糖片球菌（P. pentosaces）為發(fā)酵菌種，對(duì)鴨肉腸的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用固相微萃取技術(shù)和氣質(zhì)聯(lián)用的方法對(duì)發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在為鴨肉制品風(fēng)味產(chǎn)品加工和開(kāi)發(fā)提供更多的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃谷鴨腿購(gòu)于合肥家樂(lè)福超市；食鹽、白糖、亞硝酸鹽（食品級(jí)）、腸衣均為市售；MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1854型嗜酸乳桿菌（L.plantarum） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；F-1型戊糖片球菌（P.pentosaces） 丹麥科漢森公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCION TQ氣質(zhì)聯(lián)用儀 德國(guó)布魯克公司；CAR/PDMS固相微萃取針、固相微萃取手柄、螺口樣品瓶 美國(guó)Supelco公司；YX280A型高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZWY-100H/240型恒溫?fù)u床 上海

智城分析儀器制造有限公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；MGB-120絞肉機(jī) 佛山市依家電器實(shí)業(yè)有限公司；HHS-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；JY60型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和發(fā)酵劑制備

將嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌分別由干粉接種至MRS培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，活化2～3 次?；罨蟮木N作為原液按照4%的接種量在37 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，高速冷凍離心（5 000 r/min、10 min、4 ℃），無(wú)菌水稀釋得到所需的液體發(fā)酵劑，通過(guò)菌種計(jì)數(shù)按照一定的比例接種到肉中。

1.3.2 發(fā)酵鴨肉腸的制作工藝

工藝流程：原料肉預(yù)處理→切碎→拌料→腌制→接種→灌腸→培養(yǎng)發(fā)酵→終止發(fā)酵→蒸煮→成品

主要操作要點(diǎn)：1）原料肉預(yù)處理：選取鴨腿肉，剔除筋、腱、皮等，將鴨肉切細(xì)，并混入一定量的鴨肉脂肪。2）腌制接種：在原料肉中加入一定比例的腌制劑（3.0%食鹽、2.5%白糖、0.1%亞硝酸鈉），使其充分混勻，于4 ℃冰箱中冷藏腌制4 h。將嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌（1∶1）接種到配制好的肉餡中，攪拌均勻后，灌入腸衣中。3）發(fā)酵：發(fā)酵溫度33 ℃、相對(duì)濕度86.3 %、發(fā)酵時(shí)間48 h。終止發(fā)酵宜采用低溫終止方法，即在15 ℃條件下24 h終止發(fā)酵。4）蒸煮：在沸水中煮制20～30 min，然后蒸制15～20 min，即可食用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時(shí)間48 h，選取發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.3.2 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度選取上述最佳水平，發(fā)酵時(shí)間為48 h，選取的發(fā)酵劑添加量分別為105、106、107、108 CFU/g進(jìn)行試驗(yàn)，確定發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑添加量分別選取上述最佳水平，選取的發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h進(jìn)行試驗(yàn)，確定發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵鴨肉腸感官品質(zhì)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑添加量三因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平共17 點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)由10 名專家型人員組成，評(píng)定過(guò)程遵照“雙盲”原則，參照香腸標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23493—2009《中式香腸》并稍作修改，分別對(duì)顏色、香味、口感、形態(tài)等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分[20]，感官評(píng)價(jià)指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.4.2 揮發(fā)性風(fēng)味化合物檢測(cè)與分析

將處理好的樣品每組稱取3.0 g于螺口樣品瓶中，并用聚四氟乙烯墊密封。用75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中進(jìn)行萃取，于50 ℃水浴中吸附40 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口中于250 ℃解吸2 min，啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。每組平行檢測(cè)3 次。

1.4.2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min上升至60 ℃；再以10 ℃/min上升至100 ℃；再以18 ℃/min上升至240 ℃，保持6 min；載氣He氣；流速1 mL/min；不分流，恒壓35 kPa；進(jìn)樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，檢測(cè)溫度為240 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃；電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；燈絲電流150 μA；質(zhì)量掃描范圍33～450 m/z。

1.4.2.2 化合物定性與定量分析

化合物通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索與NIST Library數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，從而確定其化學(xué)成分。化合物相對(duì)百分含量用峰面積歸一化計(jì)算。

1.4.2.3 風(fēng)味化合物的分析

采用相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）[21]對(duì)發(fā)酵鴨肉腸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel統(tǒng)計(jì)處理，SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析，Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵鴨肉腸加工工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖1可知，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵香腸的品質(zhì)影響顯著（P<0.05）。溫度偏低，微生物產(chǎn)酸較慢，在相同發(fā)酵時(shí)間下，對(duì)香腸品質(zhì)有一定的影響；溫度過(guò)高時(shí)，微生物產(chǎn)酸迅速，pH值下降劇烈，致使香腸口感變差。因此30 ℃為較佳發(fā)酵溫度，香腸的感官品質(zhì)較好。

2.1.2 發(fā)酵劑添加量對(duì)發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖2可知，發(fā)酵劑添加量對(duì)鴨肉腸品質(zhì)的影響顯著（P<0.05），當(dāng)發(fā)酵劑添加量從105 CFU/g增加到106 CFU/g

過(guò)程中，鴨肉腸的固有風(fēng)味更加濃郁，感官評(píng)分也相應(yīng)升高。嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)，戊糖片球菌促進(jìn)發(fā)色，有效抑制污染雜菌生長(zhǎng)，兩者配合使用，能有效促進(jìn)香腸風(fēng)味形成。但發(fā)酵劑添加過(guò)多時(shí)，會(huì)使發(fā)酵香腸酸味過(guò)重，口感變差。因此較佳的發(fā)酵劑添加量為106 CFU/g。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵鴨肉腸品質(zhì)的影響

由圖3可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵香腸的品質(zhì)影響顯著（P<0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，同時(shí)有利于纖維蛋白變成凝膠狀態(tài)，改善肉品的質(zhì)構(gòu)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，感官評(píng)分最高，香腸的口感合適，味道濃郁。

2.2 發(fā)酵鴨肉腸的加工工藝優(yōu)化

由圖4a可知，響應(yīng)面坡度較陡，表明響應(yīng)值對(duì)發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵溫度的交互作用較敏感，影響顯著，這與方差分析結(jié)果一致。隨著發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵劑添加量的增加，產(chǎn)品的感官評(píng)分先增加后減少。經(jīng)分析得出發(fā)酵鴨肉腸最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時(shí)間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃，此發(fā)酵條件下感官評(píng)分為（93±4） 分。將此發(fā)酵條件與單因素試驗(yàn)的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，單因素試驗(yàn)感官評(píng)分為（90±2） 分。綜合分析，發(fā)酵鴨肉腸的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵劑添加量106 CFU/g、發(fā)酵時(shí)間54 h、發(fā)酵溫度27 ℃。

2.3 發(fā)酵鴨肉腸風(fēng)味化合物的檢測(cè)

由表4可知，從對(duì)照組和發(fā)酵組中共檢測(cè)出46 種物質(zhì)，這其中包括醛類8 種、醇類11 種、烴類10 種、酯類7 種、酸類5 種、醚類2 種、酚類1 種、胺類1 種、呋喃類1 種。與生鴨肉相比，發(fā)酵鴨肉中烴類、醛類、醇類、含氮化合物類等揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量顯著增加，這可能與菌種產(chǎn)生的脂肪酶、蛋白酶等有關(guān)，它們能引起肉中脂肪、蛋白質(zhì)發(fā)生水解，導(dǎo)致游離氨基酸和脂肪酸增加[23]。糖類和氨基酸在后期加熱過(guò)程中，發(fā)生美拉德反應(yīng)，脂質(zhì)進(jìn)一步水解，脂質(zhì)水解與美拉德反應(yīng)相互作用，對(duì)鴨肉的整體香味構(gòu)成起重要作用[24-25]。

對(duì)已知?dú)馕堕撝档幕衔镒鱎OAV方法的分析[21]，結(jié)果表明，對(duì)發(fā)酵鴨肉腸風(fēng)味起關(guān)鍵作用的物質(zhì)（ROAV≥1）為壬醛、辛醛、檸檬烯、己醛、庚醛、三甲胺、2-戊基呋喃這7 種化合物；對(duì)發(fā)酵鴨肉腸總體風(fēng)味起修飾作用的物質(zhì)（0.1≤ROAV≤1）為苯甲醛、戊醛、α-甲基苯乙醇這3 種化合物。生鴨肉中主體風(fēng)味物質(zhì)（ROAV≥1）分別是壬醛、辛醛、檸檬烯。醛類是脂肪降解的主要產(chǎn)物，可能與肉品的特征性風(fēng)味有關(guān)，它們擁有較低的氣味閾值，對(duì)肉制品的香味產(chǎn)生很大影響[26-28]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵鴨肉腸風(fēng)味起主要貢獻(xiàn)的物質(zhì)為直鏈醛類較多。直鏈醛類一般來(lái)自不飽和脂肪酸的氧化，中等相對(duì)分子質(zhì)量的醛具有清香、油香、脂香和牛脂香風(fēng)味[29]，

這可能會(huì)與鴨肉的獨(dú)特香味形成有關(guān)。此外，通過(guò)與生鴨肉對(duì)比，發(fā)酵組中還檢測(cè)出含氮類化合物和呋喃類化合物，其濃度雖然不高，但它們的閾值非常低，具有重要的感官特性[30]，所以對(duì)肉品風(fēng)味形成有一定的影響。結(jié)合發(fā)酵鴨肉腸檢測(cè)出的37 種揮發(fā)性成分來(lái)看，可認(rèn)為醛類特別是直鏈醛，為影響發(fā)酵鴨肉腸揮發(fā)性風(fēng)味的主要化合物。

3 結(jié) 論

采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵鴨肉腸加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)發(fā)酵劑添加量為106 CFU/g、發(fā)酵時(shí)間為54 h、發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)，發(fā)酵鴨肉腸具有較佳的感官品質(zhì)，鴨肉的味道濃郁，口感合適。對(duì)最佳工藝下發(fā)酵鴨肉腸進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，共檢測(cè)出醛類、醇類、烴類、酸類、酯類以及含氮類化合物等揮發(fā)性風(fēng)味成分37 種。這些揮發(fā)性成分中，醛類物質(zhì)較多，對(duì)發(fā)酵鴨肉腸的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，這主要來(lái)源于發(fā)酵劑菌種對(duì)鴨肉中碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的水解利用，以及后期加熱中氨基酸熱降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)等共同作用。

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