超聲波輔助酶解制備豬血源抗氧化肽

唐雯倩

摘 要：超聲波處理可以提高胰蛋白酶溶液的酶活力和溶解度。實驗利用超聲波處理胰蛋白酶溶液，其酶活力和蛋白酶溶解度分別提高104.9%和2.4%。針對胰蛋白酶水解豬血血紅蛋白酶解液，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率和胰蛋白酶水解度為指標(biāo)，得到最佳抗氧化肽工藝優(yōu)化條件為：超聲頻率20 kHz、超聲時間8 min、超聲功率540 W、胰蛋白酶添加量0.8%、反應(yīng)體系pH 8.0，酶解2h即可達(dá)到常規(guī)酶解6 h的酶解度，此時DPPH自由基清除率為75.78%。應(yīng)用超聲波輔助處理可以提高酶解效率，縮短工作時間。

關(guān)鍵詞：超聲波；胰蛋白酶；豬血；抗氧化肽；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼

Abstract： The activity and solubility of trypsin were found to be increased by 104.9% and 2.4% after ultrasonic treatment， respectively. Based on this result， we proposed an ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis process for preparing antioxidant peptides from porcine blood. The optimal hydrolysis parameters that produced the same degree of hydrolysis as that obtained after 6 h hydrolysis by the routine procedure were determined by using single-factor and orthogonal array designs based on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） scavenging activity as follows： ultrasonic frequency， 20 kHz； ultrasonic time， 8 min； ultrasonic power， 540 W； addition of trypsin， 0.8%； and initial pH， 8.0. The resulting hydrolysate could scavenge 75.78% of DPPH radicals. To conclude， this study demonstrates that ultrasound treatment can increase the hydrolysis efficiency of porcine blood and shorten the hydrolysis time.

Key words： ultrasound； trypsin； porcine blood； antioxidant peptides； 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH）

中圖分類號：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）11-0010-05

doi： 10.15922/j.cnki.rlyj.2015.11.003

國內(nèi)外學(xué)者利用現(xiàn)代蛋白質(zhì)分析技術(shù)在動植物蛋白的酶解液中發(fā)現(xiàn)了一些具有生物活性的肽類，比如抗菌肽[1-2]、抗氧化肽[3-5]和抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽[6-7]等?？寡趸目梢郧宄杂苫?，減輕自由基對機(jī)體的損傷；同時對紫外線引起的線粒體損傷和自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化具有明顯的保護(hù)能力[8-9]。

豬血蛋白質(zhì)含量為18.9%，被譽(yù)為“液態(tài)肉”[10-12]。豬血是良好的功能性肽源，血液蛋白源的抗氧化肽是一種安全、無毒副作用的天然抗氧化肽[13]。方俊等[14]利用屠宰場分離的菌株A32，以豬血為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵實驗，得到的豬血多肽具有一定的抗氧化活性。潘曉倩等[15]用響應(yīng)面法優(yōu)化豬血紅蛋白抗菌肽的制備工藝，酶解用時5.19 h；潘紅梅等[16]采用蛋白酶和堿結(jié)合方式酶解豬血血漿蛋白總用時長達(dá)8 h；潘風(fēng)光等[17]采用微波輔助酶解豬血制備活性肽僅需11 min。采用現(xiàn)代生物技術(shù)制備功能性肽可以大幅度縮短酶解時間，避免了因酶解時間過長而造成生物活性降低及原材料變質(zhì)等問題。

本研究通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析超聲前后胰蛋白酶的分布情況，探究超聲波對胰蛋白酶活力的影響；以新鮮豬血為原料，添加胰蛋白酶，采用超聲波輔助酶解，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化豬血源抗氧化肽制備技術(shù)，以期獲得一種高效的酶解技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬血 北京資源集團(tuán)屠宰場。

胰蛋白酶 國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；DPPH 東京化成工業(yè)株式會社；其余所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GTR10-2離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SHZ-28A恒溫振蕩搖床 太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 北京久潤天誠科技發(fā)展有限公司；PB-10型數(shù)顯酸度計 賽多

利斯科學(xué)儀器有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀 北京

市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；Synergy H4酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；電泳槽 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 豬血血紅蛋白制備

參考潘曉晴等[15]的方法，取鮮豬血，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5‰檸檬酸鈉抗凝，4 ℃離心（5 000 r/min、10 min），收集下層血細(xì)胞。將收集的血細(xì)胞超聲破碎（20 kHz、540W、2 s/2 s、10 min），得到豬血血紅蛋白。血紅蛋白溶液90℃水浴加熱10 min，變性結(jié)塊的血紅蛋白和蒸餾水混合（7∶3，m/m），均質(zhì)混勻（7 000 r/min），得到較為黏稠的血紅蛋白。-20 ℃凍藏備用。

1.3.2 超聲波對胰蛋白酶溶解度和活力的影響

稱取200 g胰蛋白酶，配制5 g/100 mL胰蛋白酶溶液。超聲波處理（20 kHz、540 W、2 s/2 s、10 min），4℃離心（5 000 r/min、5 min），收集超聲波處理后溶液。通過凱氏定氮儀分別測定超聲波處理前、后溶液中總氮含量，換算蛋白酶含量。參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[18]，采用紫外分光光度法測定蛋白酶活性，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.3 超聲輔助酶解對豬血血紅蛋白水解度的影響

分別稱取2 份200 g制備的豬血血紅蛋白，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%加入胰蛋白酶，一份37 ℃水浴振蕩，另一份經(jīng)超聲處理（450 W、9 min、20 kHz、2 s/2 s）后37 ℃水浴振蕩，調(diào)節(jié)pH 8.0，分別測定豬血血紅蛋白水解度，其中，氨基酸態(tài)氮測定參照電位滴定法[19]，總氮測定參照凱氏定氮法[20]。豬血血紅蛋白水解度按照式（1）計算。

1.3.4 超聲波輔助酶解工藝

1.3.4.1 單因素試驗

按1.3.3節(jié)制備豬血紅蛋白-胰蛋白酶溶液，超聲后用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)體系pH 8.0，37 ℃水解2 h后，90℃水浴10 min終止酶解反應(yīng)，待液體冷卻后，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，即得粗酶解液。以DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，分別考察超聲時間為3、6、9、12、15 min時，超聲功率為180、360、540、720、891 W時，超聲頻率為15、20、25、30 kHz時，胰蛋白酶添加量為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.2%時對酶解水解度的影響。

1.3.4.2 正交試驗

選擇超聲時間、超聲功率和酶用量為自變量，DPPH自由基清除率為因變量，按正交試驗因素組合進(jìn)行優(yōu)化試驗。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

參考郭善廣等[21]的方法，取100 μL粗酶解液與300 μL 6×10-5 mol/L DPPH無水乙醇溶液于離心管中，漩渦混勻。迅速吸取200 μL上述混合液于96 孔酶標(biāo)板中，反應(yīng)25 min后，用酶標(biāo)儀于518 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為蒸餾水吸光度；A1為6×10-5 mol/L DPPH無水乙醇溶液吸光度；A2為粗酶解液和無水乙醇吸光度；A3為混合液吸光度。

1.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳

參考文獻(xiàn)[22-23]方法，選擇12%分離膠、5%堆積膠。5 g/100 mL胰蛋白酶溶液加入5×Tris-Glycine緩沖液，沸水浴加熱3 min后離心混勻。每孔上樣量為10 μL，先60 V運行10 min，再恒定90 V運行約90 min結(jié)束實驗。考馬斯亮藍(lán)R-250染色10 min，洗脫液（水∶甲醇∶乙酸=

6∶3∶1，V/V）洗脫，洗脫完全后拍照分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析（Analysis of Variance，ANVOA）進(jìn)行單因素顯著性分析，采用Duncans多重比較檢驗法對正交試驗進(jìn)行顯著性分析（P<0.05），采用Excel 2013進(jìn)行圖表的制作。所有實驗均測3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對胰蛋白酶活性的影響

由圖1可知，經(jīng)超聲波處理后，胰蛋白酶活力由6.55×105 U/g增加到1.34×106 U/g，提高了104.9%；溶解度從4.67%增加到4.78%，提高了2.36%。由圖2可知，超聲前后胰蛋白酶分子亞基種類分布一致，分子質(zhì)量27～42.7 kD范圍內(nèi)有2 條較為明顯的條帶，且超聲處理的胰蛋白酶條帶顏色比未處理的深，說明超聲可以增加胰蛋白酶在溶液中的溶解度。超聲處理可以提高酶活性，并不是因為破壞了胰蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)，而是因為適宜的超聲作用產(chǎn)生空化、機(jī)械及熱效應(yīng)，這些效應(yīng)使胰蛋白酶的分子構(gòu)象趨于合理化，以及使更多的催化部位暴露，從而提高了酶與底物反應(yīng)效率[24]。

2.2 超聲波處理對胰蛋白酶水解度的影響

由圖3可知，經(jīng)超聲處理后，胰蛋白酶水解度顯著提高，超聲處理酶解液2 h左右就可以達(dá)到常規(guī)酶解6 h的水解程度。超聲輔助處理可以極大地縮短酶解時間，避免血紅蛋白因長時間放置而引起營養(yǎng)物質(zhì)的損失和變質(zhì)，極好地保證了其功能活性；類似的研究也證實了這一結(jié)論[17]。超聲波通過供給體系能量使酶活性得到增強(qiáng)，增加酶與底物的反應(yīng)幾率。有研究顯示超聲波作用功率、時間對酶活性影響顯著[25]，可能因為超聲波對酶官能團(tuán)和微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其活性[26]。超聲作用能夠提高酶解的效率，但是否對酶解液中的所提取生物活性物質(zhì)有影響，還需要進(jìn)一步地研究。

2.3 超聲條件對DPPH自由基清除率和水解度的影響

2.3.1 超聲時間對DPPH自由基清除率和水解度的影響

由圖4可知，酶解液中豬血血紅蛋白水解度和DPPH自由基清除率無線性相關(guān)性，且各水平間存在顯著性差異（P<0.05）。超聲6 min時，豬血血紅蛋白水解度為11.43%，達(dá)到最高；9～15 min水解度趨于平緩，平均水解度為9.12%?？傮w而言，超聲時間的變化對酶解液豬血血紅蛋白水解度影響不大。超聲6 min時，DPPH自由基清除率在為25.72%；9 min時達(dá)到最高，為57.53%；9 min后DPPH自由基清除率降低到40.69%左右。

超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)在一定程度上可通過降低酶解所需的活化能促進(jìn)體系的酶解，同時提高血紅細(xì)胞的破碎率，增加體系反應(yīng)的接觸面，加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)超聲處理時間大于9 min時，豬血血紅蛋白水解度反而降低，可能是由于在堿性條件下發(fā)生了成肽反應(yīng)，使得已經(jīng)被水解的游離態(tài)氨基酸縮合形成小肽或者多肽。超聲處理9 min時的酶解液的抗氧活性最強(qiáng)，說明此時體系中所產(chǎn)生的氨基酸和肽的抗氧化能力最強(qiáng)。所以，選擇7～9 min進(jìn)入正交試驗。

2.3.2 超聲頻率對DPPH自由基清除率和水解度的影響

由圖5可知，超聲頻率對豬血血紅蛋白水解度影響不顯著（P≥0.05），但不同超聲頻率條件下所得DPPH自由基清除率有顯著性差異（P<0.05）。超聲頻率在15～35 kHz范圍內(nèi)時，豬血血紅蛋白平均水解度為9.12%。同一功率下，超聲頻率越小，空化作用越容易，所以實際運用中超聲頻率一般控制在20～40 kHz[27]，超聲的空化作用引起介質(zhì)中產(chǎn)生的小氣泡急速爆裂，從而增加體系能量。20～30 kHz范圍內(nèi)DPPH自由基清除率維持一個較高的水平，可能是由于在此頻率范圍內(nèi)有利于抗氧化肽的產(chǎn)生或有利于抗氧化肽抗氧化能力的顯現(xiàn)。所以，綜合考慮，固定超聲頻率為20 kHz。

2.3.3 超聲功率對DPPH自由基清除率和水解度的影響

由圖6可知，超聲功率在180～891 W范圍內(nèi)豬血血紅蛋白水解度波動不大，540 W時水解度達(dá)到最高值11.15%，DPPH自由基清除率達(dá)到最大。一般而言，超聲波強(qiáng)度增加，則空化強(qiáng)度隨之增大，但達(dá)到一定強(qiáng)度后，空化趨于飽和，此時再增加超聲波強(qiáng)度則會產(chǎn)生大量無用的氣泡，從而增加散射衰減，降低空化強(qiáng)度。對于胰蛋白酶酶解豬血血紅蛋白而言，180～891 W超聲功率范圍內(nèi)均能促進(jìn)酶解；不同超聲功率條件下DPPH自由基清除率有顯著性差異（P<0.05），所以選擇超聲功率在540 W附近范圍內(nèi)進(jìn)入正交試驗。

2.3.4 胰蛋白酶添加量對DPPH自由基清除率和水解度的影響

由圖7可知，當(dāng)胰蛋白酶添加量小于0.5%時，豬血血紅蛋白水解度和DPPH自由基清除率總體隨添加量的增加而增加；當(dāng)大于0.5%時二者增加不顯著，但各添加量水平間有顯著性差異（P<0.05）。酶水解一定質(zhì)量的樣品，其水解能力是固定的，選擇合適的胰蛋白酶添加量可以節(jié)約成本，因此綜合考慮選擇胰蛋白酶添加量0.6%～0.8%進(jìn)入正交試驗。

2.4 超聲波輔助酶解制備豬血源抗氧化肽

在單因素試驗基礎(chǔ)上，超聲頻率為20 kHz，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，利用三因素三水平正交試驗優(yōu)化超聲波輔助酶解制備豬血源抗氧化肽，試驗結(jié)果見表1，方差分析見表2。

由表1 R值可知，各因素對超聲波輔助提取豬血源抗氧化肽的影響程度依次為：超聲時間>酶添加量>超聲功率。由表2可知，超聲時間對提取抗氧化肽影響顯著（P<0.05），而酶添加量和超聲功率對其影響不顯著。綜合比較可得，超聲頻率為20 kHz時，最佳理論試驗條件為超聲時間8 min、胰蛋白酶添加量0.8%、超聲功率540 W。對理論條件進(jìn)行驗證得到DPPH自由基清除率為75.78%，驗證結(jié)果優(yōu)于正交試驗表中的結(jié)果，說明優(yōu)化得到的效果較好。

3 結(jié) 論

在適宜的超聲條件下，超聲波輔助酶解顯著提高了胰蛋白酶的酶活力，超聲波輔助酶解2 h即可達(dá)到常規(guī)酶解6 h的程度，此時DPPH自由基清除率為75.78%；由SDS-PAGE分析中電泳條帶可知，超聲波對胰蛋白酶分子亞基的質(zhì)量分布沒有影響。通過單因素試驗和正交試驗得出，DPPH自由基清除率最佳時，制備抗氧化肽的酶解條件為：超聲頻率20 kHz、超聲時間8 min、超聲功率540 W、胰蛋白酶添加量0.8%、體系維持pH 8.0。

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