魚(yú)源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5種毒力基因的檢測(cè)和分析

王 利，茍小蘭

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersiniaenterocolitica）屬于耶爾森菌屬，腸桿菌科。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌廣泛存在于自然界中，是人、畜、魚(yú)等共患的致病菌，可引發(fā)人和動(dòng)物患胃腸炎和腹瀉，還可引起關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑，嚴(yán)重時(shí)可引起敗血癥，造成死亡。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，研究者用體外法測(cè)定小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力以代替昂貴的動(dòng)物試驗(yàn)。體外法主要包括：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的自凝性、血清抵抗性和毒力質(zhì)粒的測(cè)定等［1－2］。至今為止，對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展［3－4］。對(duì)其致病機(jī)制有了初步的認(rèn)識(shí)，但仍有許多的問(wèn)題有待深入研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）已經(jīng)用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因，迅速對(duì)該菌進(jìn)行毒力鑒定，甚至在毒力質(zhì)粒丟失后仍然可以預(yù)測(cè)該菌的致病力［5］。本試驗(yàn)采用PCR方法檢測(cè)和分析了魚(yú)源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5種重要的毒力基因：毒力活化因子基因（vir F）、粘附素基因（yad A）、粘附侵襲位點(diǎn)基因（ail）、毒力島基因（HPI-int）和耐熱腸毒素基因（ystB）。這有利于為深入探討魚(yú)源小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力和致病性積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離自四川某胭脂魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，以甘油菌的形式保存于本實(shí)驗(yàn)室－80℃冰箱，備用。

1.2 主要試劑 改良Y培養(yǎng)基和CIN-1培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自TIANGEN BIOTECH（BEIJING）；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（2000）等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)［6］，設(shè)計(jì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5對(duì)毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI－int）的引物，詳細(xì)見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 5對(duì)毒力基因引物序列

1.3.2 DNA模板制備 采用兩種方法制備小腸結(jié)腸炎耶爾森菌DNA模板。第一方法是煮沸法，主要步驟是：取營(yíng)養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落加入含50μL dd H2O的1.5 m L離心管中，混勻后放入－80℃冰箱中過(guò)夜，取出后立即放入沸水中煮10 min，12 000 r／min離心5 min，取上清液作為模板，－20℃凍存?zhèn)溆?。第二種方法是用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)的體系：dd H2O 8.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物（濃度均為10μmol／L）各1μL，模板DNA 2 μL，共25μL。ail和HPI-int毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃60 s，50℃60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。virF毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃60 s，48℃60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。另外，兩種毒力基因（ystB和yad A）則采用梯度PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化：94℃5 min；94℃60 s，退火溫度分別為45℃、50℃、55℃和60℃，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5μL，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，80V電壓，電泳30 min，凝膠成像儀下拍照。

1.3.4 HPI-int基因測(cè)序和序列分析 HPI-int基因PCR反應(yīng)采用50μL體系：dd H2O 17μL，2×TaqPCR Master Mix 25μL，上游引物和下游引物（濃度均為10μmol／L）各2μL，模板DNA 4μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)出單一條帶后，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，采用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行正反向測(cè)序。所得序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并采用生物信息學(xué)軟件DNAStar和Blastn等對(duì)該序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因檢測(cè) 分別用兩種方法制備的DNA作為模板，用PCR方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌5種毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI-int），得到的結(jié)果相似，無(wú)明顯差異。ail基因目的條帶大小約為351 bp，HPI-int基因條帶大小約為714 bp，而virF基因目的條帶大小約為561 bp，這3種基因所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果詳見(jiàn)圖1。另外兩種基因（ystB和yad A）在反復(fù)優(yōu)化PCR條件后都未擴(kuò)增出目的條帶，表明該菌株未攜帶ystB和yad A這兩種毒力基因。

圖1 毒力基因的擴(kuò)增1：ail；2：HPI-int；3：yad A；4：vir F；5：ystB；M：DNA Marker分子量

2.2 HPI-int基因序列分析 HPI-int基因分別使用正反向引物測(cè)序，采用DNAStar軟件中的Seqman對(duì)正反向序列進(jìn)行組裝、拼接，最終所得序列長(zhǎng)度為722 bp，將該序列提交到 NCBI，GenBank序列號(hào)為JX041513。采用NCBI的Blastn工具對(duì)該序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌強(qiáng)毒力島基因（Yersiniaenterocoliticaleft arm of the highpathogenicity island Score，GenBank 序 列 號(hào) 為AJ132668.1）序列的相似性為99% （705／710），因此表明HPI-int基因的測(cè)序結(jié)果和預(yù)期相符合。

3 討論

耶爾森菌的致病因素主要包括：毒力質(zhì)粒編碼的分泌系統(tǒng)、外膜蛋白、侵襲性與毒素、鐵攝取系統(tǒng)和超抗原等方面［7］。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病因素主要是該菌所具有的特殊染色體基因、毒力質(zhì)粒和菌毛。ail、HPI-int、yst A、ystB和 HPI毒力基因位于染色體上，而yad A和virF毒力基因位于質(zhì)粒上。致病性的耶爾森菌可分為低致病性和高致病性兩類。這種分類與染色體上是否攜帶有 HPI毒力島有關(guān)，因?yàn)镠PI是高毒力細(xì)菌表型表達(dá)的必需條件。這個(gè)染色體上的片段涉及生物合成、調(diào)節(jié)和耶爾森菌含鐵鐵載體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中，毒力島只出現(xiàn)于高致病性的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物1B型 ，而低致病性的則無(wú)［4］。

至今為止，對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因已經(jīng)進(jìn)行了一些研究［8－9］。典型的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶ail、yst A、yad A基因和virF毒力基因。致病性菌株不攜帶ystB，而非致病性菌株不攜帶ail、yst A、yad A、vir F。ystB主要為生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶的編碼一種性質(zhì)類似于yst A的耐熱性腸毒素。ystB僅存在于生物1A型的菌株，而且在這個(gè)生物型中，目前資料表明這類菌株通常都是非致病性菌株。81株生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均未檢測(cè)出ail、virF、yst A基因和ystC基因［10］。王鑫等（2005）運(yùn)用PCR和DNA探針雜交方法檢測(cè)了致病性和非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶的ystB基因［11］。48株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均不攜帶該基因。98株非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中有52株攜帶ystB基因，占53.06%。這表明ystB基因僅存在于部分生物1A型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，而不存在于致病性菌株中。以上多個(gè)研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)通過(guò)多次優(yōu)化PCR條件也未檢測(cè)出ystB基因，這提示該菌株很可能為致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

裴耀文等（2011）發(fā)現(xiàn)3株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株的毒力基因檢測(cè)中均表現(xiàn)為ail和yst A陽(yáng)性，而yad A、virF毒力基因缺失［12］。吉林省致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型毒力基因的分布情況表明，血清型O：3和O：9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因的分布主要為ail＋、yst A＋、ystB－、yad A＋、virF＋型，其次是ail＋、yst A＋、ystB－、yad A－、vir F－型［13］。南京地區(qū)不同來(lái)源的123株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病生物型菌株，均包含染色體上的毒力基因ail［14］。因此，ail與致病生物型之間存在明顯關(guān)聯(lián)。Zheng等（2008）用PCR方法檢測(cè)了從腹瀉病人糞便中分離出160株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的毒力基因。檢出率分別 為：ail（94%）、inv（100%）、yst A （93%）、ystB（7.5%）、ystC（5%）、yad A（89%）和virF（82%）［5］。該結(jié)果表明，并非所有的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌都攜帶了能引起疾病的染色體和質(zhì)粒上的全部毒力基因。由此推測(cè)，其中一些缺乏某種毒力基因的菌株可能具有其他的、未知的毒力標(biāo)記，從而在致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的多種發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要的作用。以上報(bào)道的結(jié)果存在一些較小的差異，可能是由于不同地區(qū)、不同菌株的差異或毒力基因的檢測(cè)片段的差異等原因。

本試驗(yàn)中檢測(cè)出了ail、vir F和HPI-int，而未檢測(cè)到y(tǒng)ad A，這與以上報(bào)道基本相一致。這也提示該菌具有致病性。HPI-int基因的測(cè)序結(jié)果分析表明，該序列與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌強(qiáng)毒力島基因的相似性達(dá)到99%，從而驗(yàn)證了本試驗(yàn)HPI-int基因檢測(cè)的正確性，也進(jìn)一步說(shuō)明該菌株具有較強(qiáng)的致病性。yad A基因未被檢出到可能是由于該基因位于質(zhì)粒上，在實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)過(guò)程中菌株多次傳代及長(zhǎng)時(shí)間平板上保存后都很容易丟失質(zhì)粒。質(zhì)粒上的毒力基因與致病生物型之間的關(guān)聯(lián)性要略低一些，因此依賴于質(zhì)粒毒力基因檢測(cè)通常是存在較大誤差。致病性耶爾森菌遺傳背景復(fù)雜，染色體DNA指紋分析具有多態(tài)性。在檢測(cè)細(xì)菌毒力基因時(shí)必須檢測(cè)染色體上的毒力因子，不能僅用毒力質(zhì)粒的檢測(cè)。選擇染色體上的毒力基因時(shí)可優(yōu)先選擇ail基因，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)避免質(zhì)粒丟失而使有毒株被誤判為無(wú)毒株。綜上所述，本試驗(yàn)運(yùn)用PCR方法檢測(cè)了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株的5種毒力基因。本菌株檢測(cè)并分析了染色體上的毒力島（HPI-int）基因，因此推測(cè)它是強(qiáng)毒力株，具有較強(qiáng)的致病性。下一步，將進(jìn)行本菌株對(duì)多種魚(yú)類的致病性試驗(yàn)，深入研究該菌株的毒性及其危害。

［1］Stern N J，Kotula A W，Pierson MD.Virulence prediction ofYersiniaenterocoliticaby pyrolysis gas-liquid chromatography［J］.Appl Environ Microbiol，1980，40（3）：646-651.

［2］Lee W H，Smith R E，DamaréJ M，etal.Evaluation of virulence test procedures forYersiniaenterocoliticarecovered from foods［J］.J Appl Bacteriol，1981，50（3）：529-539.

［3］Fabrega A，Vila J.Yersiniaenterocolitica：pathogenesis，virulence and antimicrobial resistance［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin，2012，30（1）：24-32.

［4］Kot B，Piechota M，Jakubczak A.Analysis of occurrence of virulence genes amongYersiniaenterocoliticaisolates belonging to different biotypes and serotypes［J］.Pol J Vet Sci，2010，13（1）：13-19.

［5］Zheng H，Sun Y，Mao Z，Jiang B.Investigation of virulence genes in clinical isolates ofYersiniaenterocolitica［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2008，53（3）：368-374.

［6］王增國(guó).我國(guó)部分地區(qū)攜帶ystB基因小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分子流行病學(xué)研究［D］.鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2008.

［7］古文鵬，景懷琦.耶爾森菌致病機(jī)理研究［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26（9）：862-866.

［8］Drummond N，Murphy B P，Ringwood T，etal.Yersiniaenterocolitica：a brief review of the issues relating to the zoonotic pathogen，public health challenges，and the pork production chain［J］.Foodborne Pathog Dis，2012，9（3）：179-189.

［9］Schutz M，Weiss E M，Schindler M，etal.Trimer stability of Yad A is critical for virulence ofYersiniaenterocolitica［J］.Infect Immun，2010，78（6）：2677-2690.

［10］Bhagat N，Virdi J S.Distribution of virulence-associated genes inYersiniaenterocoliticabiovar 1A correlates with clonal groups and not the source of isolation［J］.FEMS Microbiol Lett，2007，266（2）：177-183.

［11］王鑫，邱海燕，肖玉春，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒B基因（ystB）初步研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜 志，2005，21（6）：449-454.

［12］裴耀文，馮開(kāi)軍，房玉英，等.山東省宿主動(dòng)物中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分布狀況及毒力研究［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2011，27（2）：104-106.

［13］顧峰，張貴軍，劉亞?wèn)|，等.吉林省耶爾森菌O：3和O：9血清型主要毒力基因分布調(diào)查［J］.中國(guó)地方病防治雜志，2006，21（6）：340-342.

［14］許文炯，丁潔，陳曉蔚，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要毒力基因分析［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（7）：675-677.