三葉木通中酚醇和酚醇苷的生物活性研究

關(guān)樹(shù)光　於文博　潘文君　修志儒

【摘要】目的：研究三葉木通莖中的四種酚醇和兩種酚醇苷的抗氧化活性及抑制脂多糖誘導(dǎo)生成一氧化氮的活性。方法：通過(guò)對(duì)氧化自由基吸收能力（ORAC）熒光檢測(cè)法測(cè)定化合物的抗氧化活性。利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠單核細(xì)胞RAW267.4產(chǎn)生一氧化氮（NO）的含量和細(xì)胞增殖檢測(cè)法（MTT法），確定化合物抑制NO生成的作用。結(jié)果：三葉木通中的酚醇及酚醇苷類(lèi)化合物（1～6）與陽(yáng)性對(duì)照藥維生素C（Vitamin C）相比，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其中酚醇類(lèi)化合物（1～4）比酚醇苷類(lèi)化合物（5～6）的抗氧化活性更強(qiáng)；化合物（1～6）均沒(méi)有細(xì)胞毒作用；與陽(yáng)性對(duì)照藥N-單甲基-L-精氨酸（L-NMMA-a）相比，化合物（1～6）顯示了中等抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性。結(jié)論：三葉木通莖中四個(gè)酚醇類(lèi)和兩個(gè)酚醇苷類(lèi)化合物具有明顯的抗氧化活性和對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成NO的中等抑制活性。

【關(guān)鍵詞】三葉木通；酚醇和酚醇苷；NO抑制活性；抗氧化活性

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）23-0012-02

木通一詞最早見(jiàn)于《藥性賦》，在我國(guó)乃至其他亞洲國(guó)家廣泛應(yīng)用有近千年[1]。三葉木通Akebia trifoliata-（Thunb.） Koidz.是《中國(guó)藥典》收載木通藥材基源之一，具有祛心火、利尿、調(diào)經(jīng)、催乳等功效，現(xiàn)代臨床常用于抗感染、利尿。

1 儀器與材料

1.1 儀器 RF-5301 PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；MCO-15AC培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 藥材 三葉木通于2011年5月采集自江西省武寧縣九嶺山，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定為Akebia trifoliata-（Thunb.） Koidz，樣品保存于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)（樣品編號(hào)：201108006）。

1.3 試藥 96孔板（Perkin Elmert生物科學(xué)公司）；水溶性維生素E（Trolox）（美國(guó)Aldrich化學(xué)試劑公司）；維生素C（百靈威科技有限公司）；熒光素鈉鹽（Sodium Fluorescein，SF）（美國(guó)Sigma公司）；2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）（美國(guó)Wako Pure化學(xué)公司）；脂多糖（LPS）（美國(guó)Sigma公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物的提取與分離 三葉木通干燥莖，水加熱提取，濾過(guò)，濾液減壓濃縮，濃縮液經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂柱層析，分別以水、20%乙醇洗脫。20%乙醇洗脫部分再經(jīng)硅膠柱層析（氯仿- 甲醇4∶1～2∶1梯度洗脫），制備型高效液相純化（甲醇∶水=10∶90～15∶85），共獲得6個(gè)化合物?；衔铮?～6）分別為4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲醇；赤式-1-苯-（4′-羥基-3′-甲氧基）-2-苯（4″-羥基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇）；蘇式-1-苯-（4′-羥基-3′-甲氧基）-2-苯-（4″-羥基-3″-甲氧基）-1，3-丙二醇；（7S，8S）-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3 -丙三醇；2-（4-羥基-3-甲氧基苯）-乙醇1-β-D-葡萄糖苷；（7S，8S）-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯）-1，2，3-丙三醇-2-β-D-葡萄糖苷。見(jiàn)圖1[2]。

2.2 一氧化氮（NO）抑制活性測(cè)定 酚醇和酚醇苷類(lèi)化合物（1～6）對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的抑制試驗(yàn)是通過(guò)測(cè)定脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的量完成[3]。RAW264.7巨噬細(xì)胞加入改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）[含100U/ml青霉素及100-（g/ml鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）]中，于37℃，在5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)三代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于無(wú)酚紅的10% FBS-DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10.5 /ml，接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞用磷酸緩沖液（PBS）洗滌，更換新培養(yǎng)液，并加入4μg/ml LPS刺激細(xì)胞20h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用Griess法，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)生成的亞硝酸鹽含量的方法間接測(cè)定NO產(chǎn)生量。將180μl Griess試劑[0.1% N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽水溶液和1%磺胺5%磷酸溶液，體積比1∶1]加入每100μl經(jīng)LPS和待測(cè)化合物處理過(guò)的96孔板細(xì)胞上清液中。上述實(shí)驗(yàn)平行做三次。L-NMMA-a-（N-單甲基-L-精氨酸）作為陽(yáng)性對(duì)照藥[4]。

化合物（1～6）對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用也按照文獻(xiàn)方法[5]進(jìn)行測(cè)定，以避免細(xì)胞毒作用對(duì)化合物抑制iNOS的影響。

2.3 抗氧化能力指數(shù)（ORAC）測(cè)定 抗氧化能力指數(shù)測(cè)定應(yīng)用了Cao等報(bào)道的稍改良的ORAC測(cè)定法[6-7]。170μl R-藻紅蛋白（R-PE）溶解于PBS并置于96孔板中，37℃預(yù)培養(yǎng)15min后，加入10μl空白對(duì)照PBS，陽(yáng)性對(duì)照水溶性維生素E（Trolox）或化合物樣品，濃度為500、50、5、0.5、0.05μM，再加入20μl 2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）后開(kāi)始反應(yīng)，反應(yīng)液終濃度分別為R-PE 4μg/ml、Trolox 2.5μM，AAPH 12mM。維生素C用做陰性對(duì)照。上述實(shí)驗(yàn)平行三次。75min內(nèi)，熒光（激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm）每5min記錄一次，結(jié)果按下式計(jì)算：

S=（0.5+f5/f0+f10/f0+f15/f0+···i···F65/f0 + f70/f0 + f75/f0）×5

（f0 是初始熒光；fi是時(shí)間i時(shí)的實(shí)測(cè)熒光）

[（ORAC值（M）=2.5×K ×（S樣品-S空白）/（S維生素E-S空白）K是指樣品稀釋因子]

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用Student′s t、t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 結(jié)果

2.5.1 抑制脂多糖誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生活性 由表1可知，化合物（1～6）具有中等抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的活性，其中化合物（1～4）與化合物（5～6）比較作用較明顯。且化合物（1～6）均沒(méi)有細(xì)胞毒作用。

2.5.2 抗氧化活性 通過(guò)ORAC法測(cè)定化合物的抗氧化活性，結(jié)果表明化合物（1～6）均具有很強(qiáng)的抗氧化活性。見(jiàn)圖。

3 討論

一氧化氮是一種很強(qiáng)的信號(hào)分子，存在于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)乃至全身，可以透過(guò)細(xì)胞膜并傳遞特定的信息或生物信號(hào)以調(diào)整細(xì)胞的活動(dòng)，幫助機(jī)體完成特定的功能。NO可與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化亞硝基陰離子，后者是強(qiáng)氧化劑，可造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化、巰基氧化等，介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。三葉木通的酚醇及酚醇苷類(lèi)化合物在體內(nèi)外均有顯著藥理活性。

研究發(fā)現(xiàn)，三葉木通中的酚醇及酚醇苷類(lèi)化合物（1～6）通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的生成，抑制炎癥反應(yīng)。通過(guò)應(yīng)用MTT法測(cè)定了化合物（1～6）的細(xì)胞毒作用，以排除因化合物本身的細(xì)胞毒作用而干擾化合物對(duì)NO產(chǎn)生抑制活性的測(cè)定。結(jié)果表明所測(cè)化合物均沒(méi)有細(xì)胞毒作用，NO產(chǎn)生抑制活性結(jié)果可以直接反映被測(cè)化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性。同時(shí)，酚醇類(lèi)化合物（1～4）比酚醇苷類(lèi)化合物（5～6）具有更強(qiáng)的抗氧化活性。證實(shí)了三葉木通中提取的六種酚醇及酚醇苷類(lèi)化合物具有抑制NO生成的作用并對(duì)由NO誘發(fā)的多種疾病具有顯著的防治作用，也為酚醇及酚醇苷類(lèi)化合物提供了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；為提升藥材飲片、中成藥的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]梁永紅.三葉木通資源和質(zhì)量分析研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

[2]關(guān)樹(shù)光，於文博，關(guān)樹(shù)宏.三葉木通中酚醇及酚醇苷類(lèi)化學(xué)成分的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）：905-906.

[3]Han AR， Kang YJ，Windono T，et al.A new antifouling hexapeptide from a Palauan sponge， Haliclona sp[J].Journal of Natural Products，2006；69：719-721.

[4]李巖，鄺棗園，李明，等.黃芩苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞一氧化氮和一氧化氮合酶表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（6）：675-677.

[5]Liu WJ， Jiang JF， Xiao D，et al.Down-regulation of telomerase activity viaprotein phosphatase 2A actvation in salvicine-indulde human leukemia HL-60 cell apoptosis[J].Biochem Pharmacol，2002；64：1677-1678.

[6]Cao G，Prior RL.Measurement of oxygen radical absorbance capacity in biological samples[J].Methods Enzymol. 1999，299：50-52.

[7]廖暉，梁紅萍，武晉.紅花的抗氧化活性及對(duì)-葡萄糖苷的作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（9）：2131-2133.

（收稿日期：2015.08.28）