雞糞的施用對(duì)薄皮甜瓜果實(shí)糖積累及糖代謝相關(guān)酶活性的影響

靳亞忠 陳業(yè)雯 龍閃閃 李康樂 馬曉偉 何淑平 齊紅巖

(1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

甜瓜(Cucumis meloL.)是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，近年來(lái)已成為黑龍江省設(shè)施生產(chǎn)中的主要種植對(duì)象。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)果實(shí)品質(zhì)的要求不斷提高。甜瓜中糖組分及其含量對(duì)果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)有著重要的影響，是決定果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1-3]。研究表明，影響甜瓜果實(shí)糖分含量的因素很多，其中氮肥對(duì)果實(shí)糖分的積累具有明顯的調(diào)節(jié)作用[1，3-5]，且隨著化學(xué)氮肥用量的增加甜瓜果實(shí)滴定酸含量升高、可溶性固形物含量降低[4-5]、可溶性糖含量和糖酸比降低[3，5]。通過(guò)減少化學(xué)氮肥或部分替代使用化學(xué)氮肥，進(jìn)而提高甜瓜甜度已成為生產(chǎn)者和科研工作者的關(guān)注熱點(diǎn)之一。已有研究表明，有機(jī)肥及其與化學(xué)氮肥的配施，可以提高番茄[6]、西瓜[7-8]、桃[9]、蘋果[10]、冬棗[11]果實(shí)的可溶性糖含量，但不同種類的有機(jī)肥對(duì)可溶性糖含量的影響存在差異[8]。甜瓜果實(shí)中積累的糖分主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖，而果實(shí)糖分含量的差異與糖代謝相關(guān)酶活性有關(guān)，包括蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS，合成與分解兩個(gè)方向)以及轉(zhuǎn)化酶[2]。馬慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的河套蜜瓜果實(shí)中SPS和SS 合成方向活性顯著高于樓蘭王果實(shí)，導(dǎo)致果實(shí)中蔗糖含量明顯高于樓蘭王果實(shí)；在高蔗糖積累型網(wǎng)紋甜瓜克利斯托成熟果實(shí)中SPS 活性高于低蔗糖積累型網(wǎng)紋甜瓜娜依托，而微蔗糖積累型花皮梢瓜成熟果實(shí)中蔗糖積累則與酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)活性降低有關(guān)，且不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)糖分含量以及成熟果實(shí)不同部位糖分含量的差異均與果實(shí)中SPS活性、AI活性以及SS 凈活性(合成方向酶活性與分解方向酶活性差值)有關(guān)[13]。梨不同品種糖分含量存在差異，可以通過(guò)糖代謝相關(guān)酶活性高低及不同代謝酶種類相協(xié)調(diào)差異性來(lái)解釋這種現(xiàn)象[14]。關(guān)于蘋果的研究發(fā)現(xiàn)，適宜氮素用量可提高果實(shí)中果糖、蔗糖、葡萄糖的積累，而氮素過(guò)量(濃度＞0.3%)則導(dǎo)致其淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖的合成受到抑制，而淀粉代謝相關(guān)酶活性以及SPS、SS 合成方向活性以及AI活性也降低，且相關(guān)性顯著[15]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)改變有機(jī)肥料以及有機(jī)肥的用量并未提高甜瓜果實(shí)的糖含量，但能提高甜瓜產(chǎn)量[16-17]；同樣的，有機(jī)肥也未增加黃瓜果實(shí)中的糖含量[18]，Curuk 等[19]在甜瓜和西瓜中也得到了類似的結(jié)果。

有機(jī)肥部分替代或全部替代甜瓜生產(chǎn)中的化學(xué)氮肥，能否通過(guò)改變糖代謝相關(guān)酶活性進(jìn)而提高甜瓜中糖分的積累，還存在爭(zhēng)議。雞糞是一種比較優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥，其含有作物生長(zhǎng)發(fā)育所需的中微量元素、有益生物活性菌及多種酶。因此，本研究以雞糞作為有機(jī)肥，替代化學(xué)氮肥以及與化學(xué)氮肥配施，以薄皮甜瓜DX108為試驗(yàn)材料，探究雞糞、雞糞與尿素配施對(duì)甜瓜果實(shí)糖分積累以及糖代謝相關(guān)酶的影響，以期為甜瓜生產(chǎn)實(shí)際和理論研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗(yàn)采用基質(zhì)為草炭∶河沙=3∶1比例配置的混合基質(zhì)，每桶裝填10 kg 基質(zhì)。供試薄皮甜瓜為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝系甜瓜課題組繁育的DX108自交系品種(花后30～33 d 成熟)，采用穴盤進(jìn)行育苗，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出第4片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致、無(wú)病蟲害的幼苗定植于桶中，每桶定植1株甜瓜幼苗。

供試肥料為常規(guī)肥料:尿素(含N為46%)、磷酸二銨[含磷(P2O5)46.0%和含N 21.2%]、硫酸鉀[含鉀(K2O)34.3%]；試驗(yàn)用雞糞為商品雞糞:含全氮1.46%，含磷(P2O5)0.74%，含鉀(K2O)0.75%，由黑龍江牧康牧業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置雞糞+尿素配施處理(A)、雞類處理(B)和對(duì)照(CK)3個(gè)處理，其中CK為化學(xué)肥料處理。施肥用量為尿素10 g/桶、磷酸二銨6.52 g/桶、硫酸鉀8.74 g/桶，肥料的用量為純N 600 mg·kg-1、P2O5300 mg·kg-1和K2O 300 mg·kg-1；A為純N 300 mg·kg-1+雞糞(純N 300 mg·kg-1)，各肥料用量為雞糞205 g/桶、尿素5.04 g/桶、磷酸二銨3.22g/桶、硫酸鉀4.26 g/桶；B量根據(jù)純N 600 mg·kg-1計(jì)算，為410 g/桶，其中包含磷(P2O5) 3.03 mg·kg-1，含鉀(K2O) 3.08 mg·kg-1，未添加磷酸二銨和硫酸鉀。在桶中填混合基質(zhì)時(shí)，CK 一半的氮磷鉀肥料以基肥的形式混合入土，其余肥料再平均分成兩份，分別在甜瓜植株伸蔓期和果實(shí)坐果后進(jìn)行追施；A和B 所用雞糞和磷鉀肥以及A的尿素，在裝填桶時(shí)與基質(zhì)混合均勻，裝入桶中。每個(gè)處理共18 桶，分3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6 桶，隨機(jī)區(qū)組排列，置于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系實(shí)驗(yàn)基地的塑料大棚中，各處理澆水、病蟲害防治均按照統(tǒng)一的管理方式進(jìn)行。甜瓜植株按照單蔓整枝方式進(jìn)行管理，子蔓結(jié)瓜，瓜前留1片葉進(jìn)行摘心。在甜瓜果實(shí)開花當(dāng)天進(jìn)行人工授粉，并掛標(biāo)簽標(biāo)記，在花后果實(shí)生長(zhǎng)的第20、第25、第30、第35天采集甜瓜果肉樣品，置于-40℃冰柜貯藏，用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

果糖、葡萄糖、蔗糖含量的測(cè)定:取1 g 凍樣，研磨后置于10 mL 離心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液，80℃水浴30 min，冷卻后3 000×g離心10 min，收集上清液于50 mL 容量瓶中，重復(fù)以上步驟2次，合并上清液，將上清液定容至50 mL，即為3種糖的待測(cè)液。葡萄糖和果糖含量的測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[20]；蔗糖含量的測(cè)定采用NaOH-蒽酮-硫酸比色法[20]。

酶活性的測(cè)定:取1 g 凍樣置于研缽中，加入少量石英砂和10 mL HEPES 緩沖液(包括50 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH值7.5，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1MgCl2，2.5 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MVC5%不溶性PVPP)，冰浴研磨成勻漿，4層紗布過(guò)濾后，12 000×g、4℃離心20 min，吸取全部上清液；然后向其中逐漸加入硫酸銨至80%溶解度，分多次加入以確保其充分溶解，冰上放置15 min 后，12 000×g、4℃離心30 min，棄掉上清液，用3 mL 緩沖液溶解沉淀，并轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于4℃冰箱，用稀釋10倍的提取緩沖液(不含PVPP)透析20 h，透析液為待測(cè)液。SPS、SS(合成和分解方向)以及AI和中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase，NI)活性測(cè)定參考李志凌[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SPSS.19 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析；采用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理下甜瓜果實(shí)葡萄糖、蔗糖、果糖含量變化

由圖1可知，不同施肥處理對(duì)甜瓜果實(shí)葡萄糖、蔗糖、果糖含量的影響存在明顯差異，尤其在果實(shí)成熟期。隨著甜瓜果實(shí)的發(fā)育，葡萄糖、蔗糖和果糖積累發(fā)生變化，CK 甜瓜果實(shí)中葡萄糖、果糖的含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，其果實(shí)葡萄糖和果糖含量最高分別為58.48 mg·g-1(花后30 d)和62.74 mg·g-1(花后25 d)；A和B的葡萄糖、果糖含量呈不斷增加的趨勢(shì)，在生長(zhǎng)發(fā)育后期(花后35 d)，A和B 甜瓜果實(shí)中的葡萄糖和果糖含量明顯高于CK，尤其葡萄糖含量表示出顯著性差異(P＜0.05)。與CK相比，在花后35 d，A和B果實(shí)中蔗糖含量顯著增加84%以上(P＜0.05)，而B成熟果實(shí)中蔗糖含量較A 果實(shí)顯著提高了18.7%(P＜0.05)。說(shuō)明在生產(chǎn)中利用雞糞有機(jī)肥全部替代或部分替代化學(xué)氮肥能夠提高甜瓜果實(shí)中的葡萄糖、蔗糖和果糖含量，進(jìn)而改變果實(shí)甜度。

圖1 不同施肥處理對(duì)葡萄糖、蔗糖和果糖含量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on glucose，sucrose and fructose content

2.2 甜瓜果實(shí)蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性變化

在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，A和B 甜瓜果實(shí)中SPS活性變化趨勢(shì)基本一致，均呈升高趨勢(shì)(圖2-A)，且在花后35 d 達(dá)到最大值，分別為36.25 μmol·h-1·g-1和40.28 μmol·h-1·g-1?；ê?0～35 d，CK 果實(shí)中SPS活性基本處于平緩變化狀態(tài)，且顯著低于A和B(P＜0.05)。

甜瓜果實(shí)中SS 活性變化分為合成和分解兩個(gè)方向。由圖2-B可知，花后20～35 d 所有處理的甜瓜果實(shí)SS 合成方向酶活性的變化趨勢(shì)基本一致，呈先上升而后降低的趨勢(shì)。隨著甜瓜果實(shí)的發(fā)育，花后30 d時(shí)，A和B 果實(shí)中SS 合成方向酶活性均達(dá)到最大值，分別為52.03 μmol·h-1·g-1和45.24 μmol·h-1·g-1，均顯著高于CK(P＜0.05)；A 果實(shí)SS 合成方向酶活性顯著高于B 果實(shí)(P＜0.05)。

由圖2-C可知，花后20～35 d，A和B 甜瓜果實(shí)中SS 分解方向酶活性均呈先略升高后降低趨勢(shì)；CK 果實(shí)中SS 分解方向酶活性呈下降趨勢(shì)，且后期下降緩慢，而A、B 果實(shí)中SS 分解方向酶活性在花后25 d 后迅速下降，均在花后35 d 達(dá)最低值。花后30～35 d，B與CK 果實(shí)中SS 分解方向酶活性無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而花后35 d時(shí)，A 果實(shí)中該酶活性(27.89 μmol·h-1·g-1)明顯高于B(20.27 μmol·h-1·g-1)和CK(20.78 μmol·h-1·g-1)，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同施肥處理下甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)化酶活性變化(酸性和中性轉(zhuǎn)化酶活性)

在甜瓜果實(shí)中AI活性隨著果實(shí)發(fā)育整體呈降低趨勢(shì)(圖3-A)?；ê?0 d之后，甜瓜果實(shí)中AI活性迅速下降至最低(花后25 d)，且A 與B之間無(wú)顯著差異，但顯著高于CK(P＜0.05)?；ê?5 d之后，A和B果實(shí)中AI活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，但CK 果實(shí)中AI活性基本穩(wěn)定。此外，花后25～35 d，B 果實(shí)中AI活性始終顯著高于A(P＜0.05)。

由圖3-B可知，各處理甜瓜果實(shí)中NI活性在花后20～35 d 變化趨勢(shì)基本一致，隨著果實(shí)發(fā)育，NI活性逐漸升高，處理之間存在差異。CK 甜瓜果實(shí)中NI活性變化緩慢且增幅較小，而A和B 果實(shí)中NI活性變化幅度明顯大于CK，且在花后20 d之后，A和B 果實(shí)中NI活性均顯著高于CK(P＜0.05)。花后20～35 d，B 果實(shí)中NI活性顯著高于A 果實(shí)(P＜0.05)。

圖2 不同施肥處理對(duì)甜瓜果實(shí)蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments on SPS and SS activity in melon fruit

圖3 不同施肥處理對(duì)甜瓜果實(shí)酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響Fig.3 Effects of different fertilization treatments on AI and NI activity in melon fruit

3 討論

甜瓜屬于喜肥的作物，在植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)和甜瓜果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間對(duì)氮、磷、鉀肥的需求較高，尤其是氮肥和鉀肥[5，21]。此外，瓜果類蔬菜作物的產(chǎn)量和品質(zhì)除了受品種的影響外，還與施肥有關(guān)[4，6，8]。設(shè)施栽培中，生產(chǎn)者為了追求產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，化學(xué)氮肥的施用量一直處于過(guò)量狀態(tài)，導(dǎo)致肥料的利用率較低[4，8，22]。研究表明在一定氮肥施用量范圍內(nèi)，甜瓜的產(chǎn)量增加，但氮肥施用過(guò)量會(huì)導(dǎo)致甜瓜的產(chǎn)量和可溶性糖含量明顯降低[1，8，23]。諸多研究表明，有機(jī)肥全部或部分替代化學(xué)氮肥能提高瓜果類蔬菜的可溶性糖含量[6-10]。在本試驗(yàn)條件下，花后25～35 d，A、B 甜瓜果實(shí)中蔗糖、葡萄糖含量均顯著高于相同施氮量的CK(P＜0.05)，且A 優(yōu)于B，尤其是成熟果實(shí)中。這與前人在蘋果中的研究結(jié)果基本一致[10]，但與其他學(xué)者在甜瓜中的研究結(jié)果相反[16，19]。其原因有可能是有機(jī)肥種類以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥的配施比例不同，對(duì)土壤理化性質(zhì)、植物根系分泌物、植物對(duì)氮素的吸收代謝調(diào)節(jié)等作用存在差異，導(dǎo)致了果實(shí)糖積累不同[24-28]。此外，前人對(duì)扁豆研究也發(fā)現(xiàn)，等氮量下，雞糞與尿素配施通過(guò)調(diào)控根系分泌物的改變和土壤微生物數(shù)量增加及組分的變化，促進(jìn)了扁豆可溶性糖含量的增加[29]。但是有機(jī)肥種類以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥的配施影響果實(shí)糖積累差異的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

甜瓜果實(shí)糖分積累與蔗糖代謝相關(guān)酶之間的協(xié)同調(diào)控相關(guān)[12，14，16]。在蘋果中，氮肥的過(guò)量施用(氮肥濃度＞0.3%)抑制了蘋果果實(shí)中淀粉代謝酶、SPS、SS合成方向以及AI活性，進(jìn)而降低了果實(shí)中可溶性糖含量[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，A、B、CK 3種處理甜瓜果實(shí)中SPS、SS 合成方向和分解方向、AI、NI活性均表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，但A、B 顯著提高了花后20～35 d 果實(shí)中大部分代謝酶的活性。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CK 甜瓜果實(shí)蔗糖積累與AI活性呈顯著負(fù)相關(guān)，葡萄糖與SPS和SS 合成方向酶活性呈顯著正相關(guān)，而A、B 甜瓜果實(shí)中蔗糖、葡萄糖和果糖積累(除B 中葡萄糖)均與SPS、NI活性呈顯著正相關(guān)；A 甜瓜果實(shí)中蔗糖、葡萄糖和果糖積累均與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而B 甜瓜果實(shí)中蔗糖積累與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(表1)。由此可知，雞糞主要通過(guò)影響SPS、NI、SS(分解方向)之間的相互協(xié)調(diào)進(jìn)而調(diào)控甜瓜果實(shí)中糖分積累。甜瓜中糖分含量隨著化學(xué)氮素濃度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[3]，可能與氮素過(guò)量條件下抑制SPS、SS 合成酶活性有關(guān)[28]。而本研究中，雞糞與尿素配施可能緩解了化學(xué)氮肥對(duì)果實(shí)中SPS、SS合成方向酶活性的抑制作用，從而促進(jìn)了甜瓜果實(shí)糖的積累，但其調(diào)控機(jī)理尚不明確。甜瓜果實(shí)糖的代謝是一個(gè)復(fù)雜的生理代謝過(guò)程[30-31]，有多種酶參與糖的合成和代謝[32]，存在于不同細(xì)胞器中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與了糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累[33]。大量研究表明，有機(jī)肥以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥配施與純施化學(xué)氮肥相比，提高了土壤酶活性、土壤養(yǎng)分有效性，并改變了其腐殖質(zhì)組成及含量，同時(shí)改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了土壤的供肥性能，促進(jìn)了作物生長(zhǎng)并提高了果實(shí)品質(zhì)[23，28，34-36]，可能是通過(guò)氮素信號(hào)、糖信號(hào)以及激素信號(hào)傳遞，調(diào)控了植物-土壤-微生物這樣的互作系統(tǒng)，開啟了果實(shí)中糖代謝途徑“開關(guān)”基因，改變了果實(shí)糖代謝途徑，促進(jìn)了糖分在細(xì)胞中的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化以及積累的改變，從而導(dǎo)致了甜瓜果實(shí)中可溶性糖含量以及糖分含量的差異，但該推測(cè)還需利用分子生物學(xué)的手段進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 果實(shí)糖組分與相關(guān)代謝酶活性的相關(guān)系數(shù)Table1 Correlation coefficients between sugar contents and related enzyme activity in melon fruit

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用雞糞替代或部分替代尿素調(diào)節(jié)了甜瓜果實(shí)中蔗糖、葡萄糖、果糖的積累，提高了花后25～35 d 果實(shí)中蔗糖、葡萄糖的含量以及花后30～35 d 果實(shí)中果糖的含量，尤其是花后35 d 成熟果實(shí)中這3種糖含量顯著高于純化學(xué)氮肥處理果實(shí)。此外，化學(xué)肥料處理甜瓜果實(shí)中糖分積累與SPS和AI活性相關(guān)，而雞糞部分替代處理果實(shí)中糖分積累以及雞糞全部替代處理果實(shí)中蔗糖積累與SPS、NI活性呈顯著或極顯著正相關(guān)，與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而雞糞全部替代處理果實(shí)中果糖積累與SPS、NI活性呈顯著正相關(guān)，推測(cè)雞糞的施用引起糖代謝過(guò)程中這幾種酶之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致務(wù)施肥處理果實(shí)對(duì)蔗糖、葡萄糖、果糖積累產(chǎn)生了差異。但是，本研究無(wú)法解釋雞糞的施用如何啟動(dòng)甜瓜果實(shí)糖代謝途徑中的“開關(guān)”基因，進(jìn)而影響了代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性變化以及糖分的運(yùn)輸與分配。因此，還需從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步明確有機(jī)氮調(diào)控植物體內(nèi)氮信號(hào)、糖信號(hào)以及激素信號(hào)的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，進(jìn)而探究影響甜瓜果實(shí)糖代謝、運(yùn)輸及分配的分子機(jī)理。