克唑替尼抗腫瘤的研究進展

陳少波　張厚德

[摘要] 克唑替尼是目前治療非小細胞肺癌的有效藥物，研究發(fā)現(xiàn)其能抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。克唑替尼抗腫瘤作用涉及間變淋巴瘤激酶、HGF/c-MET信號通路、原癌基因蛋白酪氨酸激酶、Bim凋亡基因、雷帕霉素靶蛋白、低氧誘導(dǎo)因子1等，近年臨床治療中發(fā)現(xiàn)克唑替尼出現(xiàn)耐藥情況，未來對其抗腫瘤作用及耐藥機制仍需進一步深入研究。

[關(guān)鍵詞] 克唑替尼；抗腫瘤

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）14-0156-05

[Abstract] Crizotinib is effective to treat non small cell lung cancer， the study has found that it can inhibit the proliferation of tumor cells， induce tumor cells apoptosis and inhibit tumor cells invade and transfer. Crizotinib anti-tumor effect involving the anaplastic lymphoma kinase， HGF/c-MET signaling pathway， c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase， Bim gene， mammalian target of rapamycin， hypoxia induced factor-1， the clinical treatment has found that crizotinib appear resistance in recent years， so its anti-tumor and drug resistance mechanism still need further study in the furture.

[Key words] Crizotinib； Anti-tumor

克唑替尼（crizotinib）是小分子ATP模擬化合物，化學名為3-[（1R）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙氧基]-5-[1-（4-哌啶基）-1H-吡唑-4-基]-2-氨基吡啶，由輝瑞公司研發(fā)用于治療間變性淋巴瘤激酶ALK陽性晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌。2011年8月獲 FDA 批準在美國上市用于治療EML4-ALK融合基因陽性晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，隨后在日本、歐盟上市，2013年1月獲SFDA 批準在中國上市，商品名XALKORIR（中文名為賽瑞克）[1]。本文就克唑替尼目前的研究情況及抗腫瘤作用予以綜述。

1 臨床研究

克唑替尼的分子靶向治療具有重要里程碑，2005年發(fā)現(xiàn)克唑替尼是c-MET和ALK強效抑制劑。2006年發(fā)現(xiàn)克唑替尼對EML4-ALK融合基因表達的腫瘤細胞具有抑制作用，并開始Ⅰ期臨床試驗。2007年動物實驗研究顯示EML4-ALK是肺癌致瘤基因。2008年克唑替尼首次被納入EML4-ALK陽性腫瘤患者臨床療效觀察。2009年將Ⅰ期臨床試驗患者入選標準進行進一步調(diào)整為EML4-ALK陽性晚期NSCLC患者，研究顯示給予克唑替尼治療ORR為57%，治療8個周期時臨床獲益率為87%，6個月的PFS為72%[2]。

2011年ASCO報道克唑替尼對ALK陽性晚期NSCLC患者生存影響研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予口服克唑替尼治療ALK陽性患者1年2年生存率分別為77%和64%；未經(jīng)克唑替尼治療ALK陽性患者1年2年生存率分別為73%和33%[3]?？诉蛱婺嵩谥委烝LK融合基因陽性非小細胞肺癌患者中，客觀緩解率達到65.3%，疾病進展風險下降51.0%，克唑替尼療效顯著優(yōu)于標準化療方案，可使ALK陽性非小細胞肺癌患者顯著獲益[4]。

克唑替尼在多項臨床試驗中顯示具有抗腫瘤活性，2013 年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)NCCN與歐洲腫瘤內(nèi)科學會ESMO都已推薦ALK陽性非小細胞肺癌一線治療首選克唑替尼[5]。

2 抗腫瘤機制

克唑替尼具有良好的抗腫瘤作用，研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼能以間變淋巴瘤激酶（ALK）、肝細胞生長因子受體（c-met，HGFR）和酪氨酸激酶受體（ROS1）等為靶點，但關(guān)于其抗腫瘤作用機制仍不明確，可能通過抑制ALK和c-MET磷酸化等過程阻斷腫瘤細胞生長和存活。

2.1 間變淋巴瘤激酶（ALK）

棘皮動物微管結(jié)合蛋白4（echino-derm microtubule associated protein- like 4，EML4）與間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因（EML4-ALK），該融合基因由2號染色體短臂插入使相隔12個堿基的序列片段EML4和倒置ALK相融合而成。EML4-ALK 融合基因具有多種亞型，這些融合基因可以形成非配體依賴性二聚體，這一過程將產(chǎn)生ALK激活細胞信號通路使細胞轉(zhuǎn)化為惡性；相反，通過阻斷這些ALK信號通路能發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長[6]的作用。

目前ALK抑制劑主要通過抑制細胞通路中ALK、Akt、STAT3、ERK磷酸化，從而發(fā)揮阻滯細胞周期和促進細胞凋亡的作用。Li Y等[7]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)TAE684與克唑替尼對肺癌EML4-ALK陽性細胞株有抑制作用。McDermott U等[8]發(fā)現(xiàn)ALK抑制劑能促進ALK陽性腫瘤細胞凋亡。Sun Y等[9]在細胞實驗給予克唑替尼（0.2、4、10 μM）干預(yù)肺癌H3122細胞發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度升高細胞增殖活性下降；蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)克唑替尼作用下，磷酸化ALK蛋白及信號通路相關(guān)蛋白表達水平均下降。戴輝等[10]發(fā)現(xiàn)，克唑替尼處理肺癌細胞株H2228細胞后細胞的凋亡率顯著增加，在蛋白印跡檢測出ALK蛋白水平同時表達下降。Tanizaki J等[11]通過RNA干擾ALK基因表達發(fā)現(xiàn)能下調(diào)RAS-ERK 和JAK-STAT3信號通路作用相關(guān)蛋白表達水平。

2.2 HGF/c-MET信號通路

肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）由728個氨基酸組成的肝素結(jié)合糖蛋白，當HGF通過一定修飾后具有活化c-MET的功能。HGF、c-MET結(jié)合引起c-MET細胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化酪氨酸激酶（PTK），引起c-MET羧基末端Tyr1349和Tyr1356自磷酸化；細胞基質(zhì)中GAB1、GRB2、磷脂酶C及SRC等效應(yīng)蛋白被募集到磷酸化羧基末端磷酸化，同時吸引Src癌基因家族同源區(qū)-2、CRK、SHP2、PI3K等[12]。這些分子和酶的共同作用激活下游通路RAS- MAPK和PI3K-AKT通路，再通過其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子ETS家族和NF-B影響基因的表達和調(diào)控細胞周期。大部分腫瘤細胞中c-MET為過表達狀態(tài)，呈現(xiàn)高水平自體磷酸化，在正常細胞能減少c-MET表達控制其對HGF的反應(yīng)而產(chǎn)生異常信號通路激活[13]。

c-MET與多種癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究表明許多腫瘤患者在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均存在c-MET過度表達和基因擴增。Wang X等[14]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使c-MET基因沉默，發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞株SGC 7901中c-MET基因mRNA和蛋白表達水平均受到抑制，同時胃癌細胞株SGC7901增殖、侵襲和黏附作用受到抑制。Zou HY等[15]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)MET抑制劑克唑替尼能誘導(dǎo)細胞凋亡、減少細胞增殖及抑制血管生成；在體外動物實驗?zāi)[瘤移植能發(fā)現(xiàn)抑制MET依賴GTL-16胃癌細胞株生長及抑制U87MG惡性膠質(zhì)瘤細胞、NCI-H441肺癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲?？诉蛱婺徇€可以抑制腫瘤血管生成，當克唑替尼作用于c-MET依賴的移植瘤小鼠能起有效抗腫瘤的療效。Kwak EL等[16]發(fā)現(xiàn)克唑替尼進入胞漿后與位于細胞膜內(nèi)側(cè)酪氨酸激酶ATP結(jié)合域相結(jié)合，通過阻斷該通路的信號傳導(dǎo)來實現(xiàn)細胞的生長抑制和促進凋亡，但克唑替尼發(fā)揮作用許多環(huán)節(jié)仍有待進一步研究。

2.3 原癌基因蛋白酪氨酸激酶（ROS1）

原癌基因蛋白酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）是單體型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）在非小細胞肺癌、卵巢癌、膽管癌、胃腺癌等廣泛表達，研究顯示約1.4%非小細胞肺癌存在ROS1基因重排[17]。麻省總醫(yī)院腫瘤中心一項研究顯示，ROS1基因陽性腫瘤予以克唑替尼治療，發(fā)現(xiàn)克唑替尼對患者具有顯著的療效[18]。

ROS1受體酪氨酸激酶包含一個胞外結(jié)構(gòu)域、一個疏水性跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域；ROS1胞外部分包含一個YWTD螺旋槳域，該區(qū)域折疊成三螺旋結(jié)構(gòu)域和9個Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域[19]。目前ROS1基因發(fā)揮作用的機制仍有待進一步研究。通過激活ROS1環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)可激活眾多下游信號通路，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子、PI3K/AKT和RAS/MAPK/MEK通路[20]。Gu TL等[21]通過對Ba/F3細胞研究發(fā)現(xiàn)ROS1基因參與磷酸化SHP-2、MAP-ERK、ERK、STAT3、AKT過程，當ROS1基因抑制后上述磷酸化過程受到抑制。在體外實驗可抑制ROS1陽性HCC78細胞系能影響下游信號通路，同時引起B(yǎng)aF3/FIG-ROS陽性細胞凋亡。

ROS1激酶與ALK具有高度序列同源性，在ATP結(jié)合位點中具有77%的氨基酸序列同源性。研究發(fā)現(xiàn)ALK激酶抑制劑能對含有ROS1融合基因陽性細胞產(chǎn)生抑制作用，克唑替尼作為ALK/MET抑制劑，對HCC78細胞系也起抑制作用[22]。

2.4 Bim凋亡基因

Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是Bcl-2家族中BH3-only亞家族成員。Bcl-2基因家族第Ⅰ類具有抗凋亡作用，包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等；第Ⅱ類具有促凋亡作用，包括BAX、BAK等；第Ⅲ類具有促凋亡作用，包括Bid、Bad、Bim、Bik等[23]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族基因所編碼蛋白在一定作用形成同源、異源二聚體或多聚體，通過形成特殊孔道來破壞線粒體膜穩(wěn)定性，這一作用將引起細胞色素C釋放并最終導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生。

目前認為 Bim促凋亡機制仍不清楚，可能Bim與抗凋亡分子Bcl-2家族的成員發(fā)生結(jié)合，這將影響其與Bid、Bax和Bak結(jié)合，從而發(fā)揮促凋亡作用。在吉非替尼靶向藥物治療有效的肺癌患者中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞存在Bim 表達明顯增加現(xiàn)象，可能Bim基因在腫瘤的靶向治療中發(fā)揮重要作用[24]。目前發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合于Bim啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子，并在翻譯后水平通過磷酸化作用調(diào)控 Bim 活性[25]。

由于BcL-2家族成員蛋白介導(dǎo)EGFR基因突變的癌細胞能夠激活PI3K/AKT/mTORC和MER/ERT信號通道。Bim 廣泛表達于各種正常細胞，其凋亡調(diào)節(jié)功能存在于造血細胞、神經(jīng)細胞、乳腺癌細胞等多種細胞系中，F(xiàn)aber AC等[26]研究發(fā)現(xiàn)Bim 基因缺失容易引起凋亡受阻，最終可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。

周韶璋等[27]發(fā)現(xiàn)不同濃度克唑替尼分別處理肺腺癌H2228細胞株和肺癌A549細胞株，細胞增殖抑制率均隨藥物濃度增加而逐漸升高并呈劑量依賴性，同時克唑替尼能促進細胞凋亡；在蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)Bim 通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達從而促進細胞的凋亡；RNA干擾Bim基因后，克唑替尼誘導(dǎo)H2228細胞株凋亡率明顯降低。

賀韋東等[28]發(fā)現(xiàn)EGFR突變非小細胞肺癌藥物干預(yù)下細胞內(nèi)Bim表達增高，可能通過上調(diào)Bim基因表達水平誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

2.5 雷帕霉素靶蛋白（mTOR）

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種保守絲-蘇氨酸蛋白激酶，屬于PI3K激酶相關(guān)激酶超家族成員。PI3K/mTOR通路能直接或間接參與細胞增殖、生長和代謝等多個關(guān)鍵事件調(diào)控；在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)PI3K/mTOR 通路存在異常激活；參與加速細胞復(fù)制周期、減少細胞凋亡，并促進腫瘤細胞遷移，在卵巢癌、乳腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29]。

mTOR激酶可能與上游多個原癌基因RTKs、PI3K、Raf、 Ras等及抑癌基因PTEN、LKB1、NF1等存在一定關(guān)聯(lián)；通過PI3K/AKT途徑和Ras/Erk途徑調(diào)節(jié)細胞生長和增殖。PI3K/mTOR可由于上游基因突變等導(dǎo)致通路被激活，可導(dǎo)致細胞生長和增殖失調(diào)及凋亡調(diào)節(jié)發(fā)生功能紊亂，最終引起腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移[30]。

目前報道多個mTOR抑制劑在臨床前和臨床試驗中均顯示出較好效果。同樣戴輝等[10]發(fā)現(xiàn)克唑替尼處理肺癌細胞株H2228細胞后細胞凋亡率顯著增加，并且蛋白印跡檢測出mTOR蛋白活化形式p-mTOR水平降低，提示在調(diào)控腫瘤細胞生長方面mTOR可能具有重要作用。Tumati等[31]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過克唑替尼處理H2228細胞進行細胞周期檢測時，大量細胞停留在G1期，提示mTOR信號通路在調(diào)節(jié)細胞周期方面具有重要作用。Jain P等[32]發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路可能在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中起重要作用。

2.6 低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）

低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia induced factor-1，HIF-1）是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成的雜二聚體蛋白。HIF-1 通過調(diào)控多種相關(guān)因子和酶類表達介導(dǎo)惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[33]。Acs G等[34]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是凋亡抑制因子，能通過上調(diào)Bcl-2而抑制細胞凋亡。HIF-1α高表達能通過促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、VEGF等因子表達來保護細胞，從而避免細胞發(fā)生凋亡。Dai S等[35]發(fā)現(xiàn)主動抑制HIF-1α表達能誘導(dǎo)非p53依賴的細胞凋亡發(fā)生。

潘星辰等[36]通過對EML4-ALK陽性細胞株 H2228研究發(fā)現(xiàn)，克唑替尼作用下細胞增殖過程受到抑制及凋亡增加；當在低氧時氧依賴通路及非氧依賴通路中PI3K/AKT通路均被激活；由于低氧狀態(tài)可激活氧依賴通路促進HIF-1蛋白降解，克唑替尼可通過抑制非氧依賴通路中AKT的作用減少HIF-1蛋白合成。

3 克唑替尼耐藥

克唑替尼治療ALK陽性患者毒性反應(yīng)小、效率高，是目前ALK陽性患者一線治療藥物。由于部分患者在應(yīng)用克唑替尼治療約10個月后會對其產(chǎn)生耐藥，故非小細胞肺癌患者的總生存期并沒有明顯改善。

目前對于克唑替尼耐藥主要包括：①原發(fā)性耐受：根據(jù)5端重排基因不同， ALK存在不同融合基因，非小細胞肺癌常見融合基因EML4-ALK。由于 EML4 斷裂位點不同，不同的ALK融合基因及不同EML4- ALK變異體對克唑替尼治療反應(yīng)均不同[37]?？诉蛱婺崮退幙捎葾LK 融合基因擴增導(dǎo)致，同時ALK基因下游信號通路可能在旁信號通路作用下重新激活，最終導(dǎo)致對酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼治療失敗。②繼發(fā)性耐受：ALK 基因二次突變是導(dǎo)致腫瘤耐藥原因。非小細胞肺癌ALK基因二次突變位點分布于激酶的每一個結(jié)構(gòu)域，不同二次突變對克唑替尼的敏感性不同[38]。目前克唑替尼產(chǎn)生耐藥性受到廣泛關(guān)注，對于克唑替尼耐藥性和不同耐藥機制仍有待研究，當前重點是研制出各種聯(lián)合及替代藥物以減少或避免其耐藥性。

4 小結(jié)

當前腫瘤治療是一個全球性問題，克唑替尼從研發(fā)上市至今，廣泛應(yīng)用于臨床治療，使用時間僅僅數(shù)年，已經(jīng)為許多腫瘤患者帶來希望，尤其是間變性淋巴瘤激酶ALK陽性晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者。對于克唑替尼抗腫瘤的許多機制仍有待進一步深入研究，包括基因表達水平、蛋白受體靶點及信號通路干擾等?？诉蛱婺岑熜Ш?、不良反應(yīng)小，但近年治療過程中逐漸出現(xiàn)腫瘤細胞耐藥問題，不得不引起足夠重視，未來對克唑替尼抗腫瘤作用的研究也將繼續(xù)。

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（收稿日期：2015-03-24）