臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦梗死大鼠的影響及作用機(jī)制

單泓等

[摘要] 目的 探討臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（mesnchymal stem cells，MSCs）移植對(duì)腦梗死大鼠的影響及作用機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型，利用線栓法制作大鼠腦梗死模型；將120只大鼠隨機(jī)分成MSCs移植組、對(duì)照組；對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)；Western-blot檢測(cè)GFAP蛋白的表達(dá)。熒光顯微鏡觀察大鼠海馬結(jié)構(gòu)變化及MSCs在大鼠腦內(nèi)的分布。 結(jié)果 神經(jīng)功能檢測(cè)MSCs移植組神經(jīng)功能評(píng)分降低，對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MSCs移植組GFAP的表達(dá)量升高，7 d達(dá)高峰，對(duì)照組無(wú)明顯變化（P<0.05）。MSCs移植組MSCs在大鼠腦內(nèi)分布良好，海馬結(jié)構(gòu)層次清晰，對(duì)照組海馬神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)突觸及細(xì)胞器溶解破壞。 結(jié)論 MSCs可促進(jìn)大鼠腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)及海馬結(jié)構(gòu)的修復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性。

[關(guān)鍵詞] 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞；腦梗死；神經(jīng)可塑性

[中圖分類號(hào)] R743.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）14-0021-03

[Abstract] Objective To explore the effects and mechanism of implantation of umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs） on rats with cerebral infarction. Methods Umbilical blood MSCs were cultured in vivo， flow cytometry was applied to test cytometric immunophenotype， and model of rat cerebral infarction was made by suture method； 120 rats were randomly assigned to MSCs implantation group and control group； rats' neurological function was evaluated； western-blot was applied to test the expression of GFAP protein. Fluorescence microscope was applied to observe changes of hippocampal formation in rats as well as the distribution of MSCs in rats' brain. Results According to the test of neurological function， the score of neurological function in the experiment group was reduced， and the score in the control group was improved. The difference was statistically significant （P<0.05）. Expression of GFAP in MSCs implantation group was increased with a peak in the 7th day， while no significant changes in the control group （P<0.05）. According to the observation of immunofluorescence microscopy， the distribution of MSCs in rats' brain was good in MSCs implantation group， and the hippocampal formation showed clear layers in the experiment group. Hippocampal structures in the control group were chaotic， and synapses and organelles were dissolved and compromised. Conclusion MSCs are able to promote the repair of hippocampal structures after cerebral infarction in rats， strengthen neuroplasticity and promote the recovery of neurological functions.

[Key words] Umbilical blood mesenchymal stem cells （MSCs）； Cerebral infarction； Neuroplasticity

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）有跨胚層分化潛能，可分化為神經(jīng)細(xì)胞[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)激活神經(jīng)干細(xì)胞不是腦梗死的直接結(jié)果，而是引起了腦內(nèi)某些因子的變化，進(jìn)而作用于神經(jīng)干細(xì)胞使其增殖、分化和遷移[3]。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大鼠腦梗死模型，通過(guò)觀察臍血干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）蛋白表達(dá)的影響及移植前后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、海馬結(jié)構(gòu)的變化，旨在探討MSCs移植治療腦梗死的可能機(jī)制，為臨床治療腦梗死提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1模型制備

將河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的120只雄性SD大鼠[動(dòng)物合格證號(hào)SCXX（豫）2010-0002]于2013年3月～2014年3月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠隨機(jī)分成MSCs移植組和對(duì)照組，每組60只，制備腦梗死模型。采用線栓法將大鼠制成大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大鼠大腦中動(dòng)脈血流速度，如血流速度較栓塞前降低70%以上及Zealonga評(píng)分>1分，提示制模成功。

1.2主要儀器與試劑

免疫熒光顯微鏡，腦立體定位儀（NARISHIGE SN-3 型，日本）。

1.3 MSCs培養(yǎng)

取新鮮的臍血，淋巴細(xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞，分裝到2個(gè)50 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶中加5 mL培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d后洗去沒(méi)有貼壁的細(xì)胞并更換新鮮的培養(yǎng)液，以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。貼壁細(xì)胞完全融合以后，以2.5 g/L的胰酶消化并傳代，把傳至第2代的細(xì)胞接種在第2個(gè)6孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞濃度為1×105/mL，達(dá)到80%共融時(shí)再加入誘導(dǎo)劑。

1.4神經(jīng)功能評(píng)分

Berderson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)損傷，0分；大鼠癱瘓側(cè)前肢屈曲腹下，1分；除了1分體征外，癱瘓側(cè)推大鼠阻力下降，2分；有追尾現(xiàn)象，3分。除上述體征外，大鼠活動(dòng)量減少，4分。大鼠得分為0～4分。分別于術(shù)后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。2～4分者說(shuō)明模型復(fù)制成功。選取2分以上的模型大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5免疫組化及免疫熒光

取大鼠腦組織，40 g/L多聚甲醛固定，行常規(guī)冰凍切片，對(duì)切片進(jìn)行HE染色及免疫熒光顯微鏡觀察。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)200倍視野，Simple-PCI圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MSCs移植組與對(duì)照組均于術(shù)后2～3 d內(nèi)活動(dòng)減少，體重減輕，3 d后體重開(kāi)始增加，皮毛光澤及亮度均好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)亦明顯改善，自主活動(dòng)增加。MSCs移植組恢復(fù)較對(duì)照組快。

術(shù)后6 hMSCs移植組和對(duì)照組均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，到第14天時(shí)，對(duì)照組大鼠神經(jīng)評(píng)分仍然在2分以上。MSCs移植組在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0027<0.01），對(duì)照組在6 h、24 h、3 d、7 d、14 d比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0630>0.05）。由此可見(jiàn)，隨著MSCs的持續(xù)治療，MSCs移植組腦出血大鼠神經(jīng)功能逐步恢復(fù)，對(duì)照組則無(wú)明顯變化。見(jiàn)表1。

大鼠腦組織病理觀察及免疫組化觀察海馬區(qū)域神經(jīng)生成見(jiàn)圖1、2。Western blot 觀察GFAP蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖3。

3 討論

腦梗死引起的神經(jīng)元不可逆死亡，梗死區(qū)周邊的成熟神經(jīng)元不能再生，因此腦梗死預(yù)后不佳。MSCs在某些微環(huán)境作用下具有類似胚胎干細(xì)胞的高度分化潛能，研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植于受損動(dòng)物的腦組織中，可促進(jìn)動(dòng)物神經(jīng)功能的恢復(fù)[4]。因而采用MSCs移植治療腦梗死成為研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)表明，造模后MSCs移植組和對(duì)照組大鼠出現(xiàn)功能及行為異常，病變對(duì)側(cè)肢體出現(xiàn)不同程度的癱瘓，表現(xiàn)為追尾現(xiàn)象、不能站立等，功能異常程度與病變嚴(yán)重程度一致。對(duì)照組與MSCs移植組比較，3 d、7 d、14 d后神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)照組高于MSCs移植組（P<0.05）。說(shuō)明MSCs可明顯改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙，其具體機(jī)制尚不明確，可能與腦水腫減輕、顱內(nèi)壓的降低和腦出血灶吸收有關(guān)。移植2周后，大鼠腦梗死灶周邊可見(jiàn)綠色熒光細(xì)胞，說(shuō)明MSCs可在大鼠腦組織中存活。研究表明，MSCs移植到大腦不同部位后，能根據(jù)大鼠腦內(nèi)的微環(huán)境變化來(lái)分化不同腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞[5]。海馬主要與記憶功能相關(guān)，是學(xué)習(xí)的重要結(jié)構(gòu)，尤其是近期的記憶功能，其損傷范圍與障礙程度成正比[6]，所以，本實(shí)驗(yàn)選取海馬作為研究部位。免疫組化顯示MSCs移植組大鼠海馬結(jié)構(gòu)層次清晰，而對(duì)照組則紊亂，無(wú)規(guī)則。GFAP是近來(lái)廣泛受到重視的腦損傷應(yīng)檢測(cè)的神經(jīng)特異性標(biāo)志物，也是神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）分化的標(biāo)記物[7]，檢測(cè)GFAP可以早期反映大腦損傷，也可以直接反映移植效果。Western blot顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，MSCs移植組GFAP蛋白表達(dá)升高，7 d達(dá)到高峰期，隨后開(kāi)始下降。這說(shuō)明移植MSCs可能抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生，減輕腦梗死后膠質(zhì)瘢痕的形成，使星形膠質(zhì)細(xì)胞適度活化以發(fā)揮其損傷修復(fù)作用，因此我們認(rèn)為MSCs移植后抑制膠質(zhì)瘢痕的形成是腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制之一，究其機(jī)制可能是MSCs通過(guò)釋放細(xì)胞因子而調(diào)節(jié)GFAP的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。

MSCs促使腦組織功能恢復(fù)的機(jī)制尚不清楚，Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)MSCs移植治療腦梗死后，腦內(nèi)僅有1%～2%的MSCs表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物，5%表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)很難簡(jiǎn)單地用這些細(xì)胞分化為有功能的神經(jīng)細(xì)胞來(lái)解釋，目前認(rèn)為，MSCs移植修復(fù)受損腦組織的機(jī)制極其復(fù)雜，即有MSCs分泌細(xì)胞因子及神經(jīng)因子的調(diào)節(jié)作用，又有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞產(chǎn)生的替代作用，同時(shí)還有因新生血管改善供氧條件等影響[9]。本研究根據(jù)MSCs移植后海馬結(jié)構(gòu)的變化及GFAP表達(dá)量，初步探討了MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化、代替壞死神經(jīng)細(xì)胞、進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，而這些神經(jīng)樣細(xì)胞能否真正代替壞死神經(jīng)細(xì)胞，機(jī)體又如何發(fā)揮調(diào)控作用，什么時(shí)間移植效果最好，尚需進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2014-11-28）