腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究

王建新

[摘要] 目的 研究腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）對(duì)非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡作用，探討TRAIL治療肺癌的可行性。 方法 （1）單用組：?jiǎn)斡貌煌瑵舛鹊腡RAIL溶液處理A549并與白血病Jurkat細(xì)胞對(duì)照；（2）聯(lián)合組：相同濃度的TRAIL聯(lián)合不同化療藥物處理A549并與對(duì)應(yīng)的單純化療藥物對(duì)照，用MTT法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理前后A549細(xì)胞的凋亡發(fā)生率并比較。 結(jié)果 TRAIL溶液能使部分體外非小細(xì)胞肺癌發(fā)生凋亡，TRAIL溶液濃度與細(xì)胞凋亡率在一定程度上呈正相關(guān)；聯(lián)合化療藥物后的TRAIL溶液對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅能力顯著強(qiáng)于單用化療藥物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 TRAIL可誘導(dǎo)小部分非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外凋亡，其凋亡作用在一定范圍內(nèi)與TRAIL濃度呈正相關(guān)，TRAIL聯(lián)合常用化療藥物有協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；凋亡

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）14-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of TNF-related apoptosis inducing ligand （TRAIL） in inducing apoptosis in non-small cell lung cancer， and to explore the feasibility of TRAIL in treatment of lung cancer. Methods The single group： the cells in the two group with solutions of different concentrations of TRAIL A549 and the feasibility of TRAIL treatment between the NSCLC group and the Jurkat leukemia cell group was compared. The combination group： same concentrations of TRAIL combined with different chemotherapy treatment A549 and the corresponding chemotherapy drugs were compared， apoptosis was detected by MTT assay before and after treatment of A549 cells the incidence of parallel statistical comparison. Results TRAIL was able to make part of the non-small cell lung cancer apoptosis in vitro， TRAIL apoptosis rate and concentration had a positive correlation to some extent； TRAIL solution after combination chemotherapy drugs kill tumor cells was significantly stronger ability to eliminate drugs in the chemotherapy alone， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion TRAIL can induce lung cancer cells in vitro， small portion of non-small cell apoptosis of apoptosis within a certain range of concentrations are positively related with TRAIL， TRAIL combined chemotherapy drugs have synergistic apoptosis of tumor cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand； Apoptosis

惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高，在包括手術(shù)切除、放療、化療等治療方式但療效又令人不甚滿意的大背景下，需要尋找新的有效治療的思路和手段。利用腫瘤壞死因子治療惡性腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)之一，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（TNF）超家族中的又一成員，但與TNF家族成員TNF和FasL的高毒性不同，TRAIL能夠選擇性的介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，卻不介導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡[1]。這一特性使其在腫瘤治療領(lǐng)域前景廣闊，也是近年來研究較熱的主要原因。非小細(xì)胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的75%～80%[2]，幾乎所有的NSCLC患者在病程的不同時(shí)期均需要接受藥物化療，費(fèi)用昂貴，且有骨髓移植、肝腎功能損害等毒副作用，若能利用TRAIL靶向?qū)鼓[瘤細(xì)胞可解決這一難題。本次實(shí)驗(yàn)主要研究體外TRAIL試劑對(duì)NSCLC細(xì)胞株A549的誘導(dǎo)凋亡作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人NSCLC細(xì)胞株A549由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，人T細(xì)胞株Jurkat購于ATCC，順鉑、阿霉素、紫杉醇分別為Bristol-Myers Squibb、Pharmacia&Upjohn、Immunex公司產(chǎn)品，TRAIL溶液購于三博遠(yuǎn)志生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 細(xì)胞解凍后，RPMI1640培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)6代，轉(zhuǎn)移分組，每組細(xì)胞濃度約為1×105個(gè)/mL，觀察至對(duì)數(shù)生長期后，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度后將細(xì)胞按每孔1×104個(gè)/200 μL接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 TRAIL溶液及藥物處理 ①單用組：A549細(xì)胞貼壁生長后加入新鮮配制的含不同濃度的TRAIL（1、10、100、1000 μg/L）培養(yǎng)液，對(duì)照組為同濃度的培養(yǎng)液添加到貼壁生長的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)基中，兩組均置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中24 h；②聯(lián)合組：聯(lián)合化療藥物組取含100 μg/L TRAIL的培養(yǎng)液3份9 mL，分別加入阿霉素（5 μmol/L）、順鉑（10 μmol/L）、紫杉醇（5 μmol/L）1 mL，混合后用于培養(yǎng)A549貼壁細(xì)胞；單用化療藥物組為不含TRAIL的培養(yǎng)液加入上述3種同等濃度劑量的藥物后，培養(yǎng)A549貼壁細(xì)胞，均置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 每個(gè)培養(yǎng)基均分為兩組，一組用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，另一組用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率，分別取上述每個(gè)培養(yǎng)基中細(xì)胞1×106個(gè)，經(jīng)pH 7.4、0.01 mol/L的PBS溶液洗滌后，70%低溫乙醇4℃固定48 h，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性；另一組經(jīng)上述洗滌、固定、并行碘丙啶染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果均由3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（x±s）形式表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MTT法與流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表現(xiàn)一致，存在線性相關(guān)，與同類統(tǒng)計(jì)相符，說明此次統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠。

2.1 單用組兩組細(xì)胞凋亡率比較

單用組A549細(xì)胞總體凋亡率低于白血病Jurkat細(xì)胞，隨著TRAIL濃度的升高，NSCLC細(xì)胞凋亡也升高，在一定程度上呈正相關(guān)，見圖1、2。

2.2 聯(lián)合組兩組細(xì)胞凋亡結(jié)果比較

TRAIL聯(lián)合化療藥物處理A549細(xì)胞株與單用化療藥物組相比，細(xì)胞凋亡率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3 討論

人類TRAIL基因定位于3號(hào)染色體的3q26，其mRNA廣泛表達(dá)于外周血單核細(xì)胞（PBMC）、肺、卵巢、腸管等多種器官組織中，但不表達(dá)于人腦、肝臟和睪丸[3]。TRAIL是由281個(gè)氨基酸組成的典型Ⅱ型跨膜蛋白，其N端（胞內(nèi)區(qū)域）沒有信號(hào)肽，第15～40位氨基酸為疏水區(qū)域，形成跨膜結(jié)構(gòu)，胞外C末端的114～281位氨基酸為其活性部位，機(jī)體內(nèi)的蛋白酶能夠?qū)⑦@部分胞外氨基酸鏈水解成可溶性單體，可溶性單體可與TRAIL受體結(jié)合，發(fā)揮生物效能。

提及TRAIL受體，目前發(fā)現(xiàn)的人TRAIL受體共5個(gè)，包括4個(gè)非可溶性細(xì)胞膜受體（2個(gè)死亡受體、2個(gè)誘騙受體）和1個(gè)可溶性受體[4]。2個(gè)死亡受體分別是死亡受體4（death receptor 4，DR4）和死亡受體5（DR5），均為Ⅰ型跨膜蛋白，上文所述的TRAIL胞外氨基酸被蛋白酶水解為可溶性單體，3個(gè)可溶性單體通過Cys230螯合一個(gè)鋅離子，形成有活性的同源三聚體，同源三聚體可與DR4/DR5結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

有研究用Northern雜交發(fā)現(xiàn)[5]，兩種死亡受體DR4/DR5 mRNA的組織表達(dá)范圍與TRAIL相似；并且國內(nèi)王績(jī)英等[6]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌組織中DR4、DR5均為陽性表達(dá)。這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為TRAIL治療惡性腫瘤，特別是對(duì)抗非小細(xì)胞肺癌奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。本次實(shí)驗(yàn)單用組結(jié)果：TRAIL體外誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡，總凋亡率低于對(duì)白血病Jurket細(xì)胞的凋亡率。白血病Jurket細(xì)胞TRAIL死亡受體的陽性表達(dá)，在TRAIL研究領(lǐng)域已是共識(shí)，這也是眾多研究TRAIL誘導(dǎo)惡性腫瘤凋亡實(shí)驗(yàn)選用Jurket細(xì)胞作為對(duì)照的原因所在。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，體外環(huán)境下NSCLC細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性不及Jurkat細(xì)胞，原因可能有以下3點(diǎn)：①兩種細(xì)胞死亡受體表達(dá)程度不同[7]，Jurkat細(xì)胞DR4、DR5的表達(dá)率高于NSCLC細(xì)胞；②兩者均在體外實(shí)施誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，TRAIL誘導(dǎo)兩者體內(nèi)凋亡對(duì)內(nèi)環(huán)境的需求至今尚未闡明，若存在需求不同，而體外為同一環(huán)境，可能存在對(duì)兩者凋亡的不平衡性因素；③NSCLC細(xì)胞為實(shí)體腫瘤組織細(xì)胞，人白血病Jurkat為非實(shí)體腫瘤細(xì)胞，兩者本身特性及生存能力存在差異[8]。

實(shí)體腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)有兩種主要方式：一是前文所述的死亡受體途徑，另一個(gè)是線粒體途徑。臨床上常見的經(jīng)典抗腫瘤藥物作用機(jī)制主要涉及線粒體途徑。但是這兩種信號(hào)途徑并不完全獨(dú)立，Caspase的序貫激活是細(xì)胞凋亡的特征性變化[9]，Caspase存在多種亞型，功能不一，Caspase8、Caspase10是啟動(dòng)型，Caspase3、Caspase6為效應(yīng)型代表，其中在細(xì)胞凋亡過程中，效應(yīng)型Caspase3作用最為重要，它是死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑中多種Caspase的共同底物[10]，聯(lián)合兩種途徑的同時(shí)酶切及幾乎所有的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，保證凋亡的不可逆轉(zhuǎn)性。施敏驊等[11]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗腫瘤藥物處理后的NSCLC細(xì)胞中Caspase3活性在基礎(chǔ)水平上有明顯提高，且有濃度依賴關(guān)系。本次實(shí)驗(yàn)中聯(lián)用組結(jié)果顯示，采用TRAIL聯(lián)合常用腫瘤藥物處理NSCLC細(xì)胞凋亡率明顯高于單用抗腫瘤藥物處理的結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其原因可能是TRAIL與抗腫瘤藥物通過兩種途徑分別激活不同的Caspase，并級(jí)聯(lián)合放大有關(guān)凋亡信號(hào)，因而對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了更為強(qiáng)烈的協(xié)同作用[12]。這是研究者們所期待的，也是TRAIL在抗腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊的原因所在。本次實(shí)驗(yàn)旨在研究TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，對(duì)不同種類抗腫瘤藥物作用結(jié)果的不同未作統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比及闡述。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示TRAIL能夠在體外誘導(dǎo)部分NSCLC細(xì)胞凋亡，并與常用的抗腫瘤藥物存在協(xié)同關(guān)系。但畢竟是體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性對(duì)TRAIL選擇性殺傷NSCLC細(xì)胞有何影響還有待闡述，但有利的是NSCLC細(xì)胞存在允許TRAIL發(fā)揮凋亡作用的死亡受體，并且TRAIL與抗腫瘤藥物在對(duì)抗腫瘤方面有協(xié)同作用。這些特性使TRAIL有望在靶向治療NSCLC及耐藥性NSCLC[13]方面取得突破。

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（收稿日期：2014-11-04）