趨化因子受體CCR7在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用研究

王歡等

[摘要] 目的 構(gòu)建pLVX-Puro-CCR7穩(wěn)定表達系統(tǒng)并研究CCR7基因在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用。 方法 采用PCR方法擴增CCR7基因并構(gòu)建pLVX-Puro-CCR7重組質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞株，嘌呤霉素對該細胞株進行篩選并建立穩(wěn)定表達細胞株。Western blot方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901細胞中CCR7表達情況。Transwell方法分析過度表達CCR7基因?qū)GC7901胃癌細胞體外遷移的影響。活體成像觀察過度表達CCR7 的SGC7901胃癌細胞株在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。 結(jié)果 成功構(gòu)建pLVX-Puro-CCR7重組質(zhì)粒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細胞株，該細胞株能夠正確翻譯及表達CCR7蛋白。過度表達CCR7基因的SGC7901胃癌細胞株體外遷移能力和在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力顯著增強（P<0.05）。 結(jié)論 CCR7可能參與促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移的功能。

[關(guān)鍵詞] 趨化因子受體CCR7；pLVX-Puro質(zhì)粒；SGC7901細胞；胃癌；轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）15-0014-03

[Abstract] Objective To construct stable expression system of pLVX-Pro-CCR7 and study the function of CCR7 gene in metastasis of stomach cancer. Methods PCR method was used to amplify CCR7 gene and construct pLVX-Puro-CCR7 recombinant plasmid. Lipofection was used to infect SGC7901 cell strain immediately， and puromycin was used to screen the cell strain and establish a cell strain with stable expression. Western blot method was used to test the expression of CCR7 in SGC7901 cells which were stably infected. Transwell method was used to analyze the effect of overly expressed CCR7 gene on in vitro migration of stomach cancer cells of SGC7901. Living imaging was used to observe the metastasis ability of stomach cancer cell strain of SGC7901 which overly expressed CCR7 in nude mice. Results pLVX-Puro-CCR7 recombinant plasmid was successfully constructed and SGC791 cell strain was stably infected. The cell strain was able to correctly translate and express CCR7 protein. Metastasis ability in nude mice and in vitro migration ability of SGC7901 stomach cancer cell strain which overly expressed CCR7 gene significantly improved （P<0.05）. Conclusion CCR7 may be involved in the function of promoting metastasis of stomach cancer cells.

[Key words] Chemokine receptor CCR7； pLVX-Puro plasmid； SGC7901 cell； Stomach cancer； Metastasis

胃癌是臨床常見的消化道腫瘤，是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。早期胃癌治療效果較好，但由于胃癌早期癥狀表現(xiàn)不明顯，而大多數(shù)胃癌患者就診時已達晚期，癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而延誤治療的最佳時機。癌細胞可通過直接浸潤、血道轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移以及腹腔種植性轉(zhuǎn)移等轉(zhuǎn)移方式向鄰近的肝、肺、胰腺、腹膜、卵巢等器官轉(zhuǎn)移，給胃癌的治療帶來很大的困難[2，3]。已有研究顯示趨化因子受體在腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中有著重要的作用，其中腫瘤細胞高表達趨化因子受體，并向釋放趨化因子的遠端靶器官進行轉(zhuǎn)移[4，5]。研究提示趨化因子受體-7（chemokine receptor 7，CCR7）是7次跨膜受體G蛋白耦聯(lián)受體，通過與其配體CCL21相互作用在淋巴細胞的歸巢過程中起到重要作用，該蛋白表達異常與惡性淋巴細胞的浸潤有關(guān)，在胃癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[6-8]。然而，CCR7 在胃癌細胞的遷徙及轉(zhuǎn)移功能尚未完全闡明，本研究擬通過構(gòu)建pLVX-Puro-CCR7的真核表達系統(tǒng)，并將其轉(zhuǎn)染至SGC7901細胞株內(nèi)使其穩(wěn)定表達，初步探討CCR7在胃癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗所需pLVX-Puro質(zhì)粒購自Clontech公司，穩(wěn)定表達熒光素酶的SGC7901細胞和大腸桿菌DH5α為浙江省人民醫(yī)院檢驗中心保存。實驗中所用的BglⅡ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶，高保真pfu聚合酶以及T4連接酶購自Takara公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。熒光素酶底物購自美國Promega公司。真核細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購買于Invitrogen公司；嘌呤霉素為美國Life technology公司產(chǎn)品產(chǎn)品?？谷薈CR7及β-actin抗體為eBioscience公司；辣根過氧化物酶標記的IgG購自美國CST公司。

1.2 SGC7901細胞的培養(yǎng)

熒光素酶標記的SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)至貼壁，3 d后用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)一次。

1.3穩(wěn)定表達CCR7的熒光素酶-SGC7901胃癌細胞株的建立

首先采用淋巴細胞分離液分離健康人外周血中單個核細胞并提取總RNA，在NCBI基因庫中獲取CCR7 基因的CDS序列并設(shè)計帶有酶切位點的引物，由上海生工有限公司合成，使用高保真pfu聚合酶擴增CCR7基因的序列，并在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。將PCR反應(yīng)電泳回收產(chǎn)物和pLVX-Puro質(zhì)粒分別酶切進行電泳并回收，T4連接酶連接，使CCR7與pLVX-Puro質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取pLVX-Puro-CCR7重組質(zhì)粒。SGC7901胃癌細胞計數(shù)約為5×105接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中6 h后使細胞融合度達到75%。將4 μg的質(zhì)粒或10 μL的LipofectamineTM2000脂質(zhì)體溶液分別用250 μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋混勻并放置30 min備用。棄去6孔板中培養(yǎng)液上清液，緩慢將上述混勻液加入6孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育8 h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，96 h后用含有0.25 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基篩選瞬時轉(zhuǎn)染細胞株，并挑取單克隆細胞株進行培養(yǎng)，待細胞大量擴增后收集細胞并提取細胞總蛋白。

1.4 Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCR7的SGC7901細胞中CCR7的表達

常規(guī)培養(yǎng)熒光素酶-SGC7901或熒光素酶-CCR7-SGC7901細胞，吸去培養(yǎng)上清液，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白。蛋白分離：首先95℃變性10 min處理樣品，變性蛋白樣本在SDS-PAGE膠上180 V，40 min進行分離電泳。轉(zhuǎn)膜：將分離后的蛋白采用60 V，120 min轉(zhuǎn)至硝化纖維膜；轉(zhuǎn)膜后的纖維膜用0.1% Triton-PBS溶液洗滌3次，10 min/次，脫脂奶粉封閉30 min，加入CCR7和β-actin一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜5次，10 min/次，充分洗滌后加入相應(yīng)種屬HRP-IgG二抗室溫孵育30 min，再用1×TBST洗膜5次，15 min/次，ECL顯色試劑盒進行顯色和曝光。

1.5體外胃癌細胞遷移能力的檢測

預(yù)先培養(yǎng)的細胞（熒光素酶-SGC7901或者熒光素酶-CCR7-SGC7901細胞）常規(guī)消化、離心，并用無血清培養(yǎng)基重懸取0.3×105細胞接種到Transwell培養(yǎng)板的上室中，在transwell下室中加入0.5 mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)，24 h后將小室置于另一個24孔板中并加入100%甲醇并固定10 min，后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，雙蒸水清洗殘余染料，將固定胃癌細胞的薄膜在顯微鏡下進行拍照。

1.6 體內(nèi)胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的檢測

熒光素酶-SGC7901或者熒光素酶-CCR7-SGC7901細胞常規(guī)消化、離心和計數(shù)后并調(diào)整為1×106細胞/100 μL PBS的細胞濃度，將100 μL細胞懸液分別注射到5只清潔級6周大小雄性BALB/c裸鼠（20～25 g）的尾靜脈中。細胞懸液注射10周后，對小鼠氣體麻醉后并在腹腔注射無菌PBS溶解的熒光素酶底物（小鼠體重150 μg/g），20 min后在小鼠活體成像儀（美國，Xenogen公司）進行小鼠體內(nèi)胃癌細胞轉(zhuǎn)移情況的檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

熒光素酶-SGC7901及熒光素酶-CCR7-SGC7901細胞之間體外遷移能力差異比較采用Mann-Whitney U test分析。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳及測序

取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90V電泳30 min后可在約1100 bp處觀察到電泳條帶。挑取陽性PCR擴增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行比對確定為CCR7基因。見圖1。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLVX-Puro-CCR7重組質(zhì)粒的SGC7901細胞中CCR7的蛋白水平的檢測

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在約43kDa（CCR7）和42kDa（β-actin）處可見到特異性條帶，CCR7-SGC7901重組條帶顏色相比SGC7901對照組顏色明顯加深（圖2），表明轉(zhuǎn)染pLVX-Puro-CCR7質(zhì)粒并進行嘌呤霉素篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細胞株能夠正確表達及翻譯。

2.3穩(wěn)定表達CCR7對胃癌SGC7901細胞體外遷移能力的影響

Transwell實驗表明，穩(wěn)定表達CCR7的SGC7901細胞組體遷移細胞數(shù)目明顯增多，見圖3A和3B；熒光素酶-SGC7901（SGC7901）或者熒光素酶-CCR7-SGC7901（CCR7-SGC7901）每組隨機抽取10個視野，計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGC7901組遷移細胞數(shù)目為（18.4±1.51）個/HPF，而CCR7-SGC7901組遷移細胞數(shù)目為（69.6±9.59）個/HPF，統(tǒng)計學(xué)比較顯示穩(wěn)定表達CCR7對SGC7901顯著增強胃癌細胞的體外遷移能力，圖3C（P<0.05）。

2.4穩(wěn)定表達CCR7對胃癌SGC7901細胞體內(nèi)遷移能力的影響

小鼠尾靜脈注射10周后進行活體成像，實驗組熒光素酶-CCR7-SGC7901細胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況較對照組熒光素酶-SGC7901相比，其體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力顯著增強。見封三圖2。

3討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的特征之一，也是臨床上絕大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因。趨化因子（chemokine）是一類有多種不同類型細胞分泌、能使免疫細胞發(fā)生趨化運動的一類細胞因子，在淋巴細胞的定向遷移[9]、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用[10]。研究表明腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移受趨化因子的嚴格調(diào)控，而且趨化因子及趨化因子受體在腫瘤的遠端轉(zhuǎn)移具有組織和器官的選擇性[11]，大量研究已經(jīng)證實：趨化因子及其受體在腫瘤器官選擇性轉(zhuǎn)移的作用機制，與其機體淋巴細胞歸巢中的作用機制十分相似[12]。CCR7屬于CC類趨化因子受體的成員之一，在幼稚T細胞、B細胞及樹突狀細胞表面表達，CCR7的配體是CCL21，通過與其配體CCL21相互作用在淋巴細胞的歸巢過程中起重要作用。已有研究表明CCR7 的表達與食管癌、胰腺癌以及胃癌淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切關(guān)系[3，5，8，13，14]。但CCR7與胃癌的遠端轉(zhuǎn)移尚未見報道。

為了證實CCR7與胃癌遠端轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究通過嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染CCR7重組質(zhì)粒的胃癌細胞株進行篩選，建立帶有熒光素酶并同時穩(wěn)定過表達CCR7的SGC7901胃癌細胞株，并在此過表達細胞株的基礎(chǔ)上，通過體外及體內(nèi)實驗證明了趨化因子受體在胃癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。CCR7不僅可以在體外促進SGC7901胃癌細胞的遷移，而且可以促進小鼠模型體內(nèi)胃癌細胞的轉(zhuǎn)移，從而對趨化因子受體CCR7在胃癌的遠端轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

然而，研究通過對裸鼠進行尾靜脈建立胃癌轉(zhuǎn)移模型，只模擬了胃癌細胞的血行及遠端定植轉(zhuǎn)移能力，具有一定的缺陷性，沒有在胃中原位接種胃癌細胞反映胃癌細胞的原位轉(zhuǎn)移能力。因此，CCR7細胞在胃癌細胞中如何被調(diào)控及通過淋巴系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)移仍需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] Luo ZY，Wang YY，Zhao ZS，et al. The expression of TMPRSS4 and Erk1 correlates with metastasis and poor prognosis in Chinese patients with gastric cancer[J]. Plos One，2013，8（7）：e70311.

[2] Hashimoto T，Arai K，Yamashita Y，et al. Characteristics of intramural metastasis in gastric cancer[J]. Gastric Cancer，2013，16（4）：537-542.

[3] Li W，Ye F，Wang D，et al. Protein predictive signatures for lymph node metastasis of gastric cancer[J]. Int J Cancer，2013，132（8）：1851-1859.

[4] Forster R，Ohl L，Henning G. Lessons learned from lymphocytes：CC chemokine receptor-7 involved in lymphogenic metastasis of melanoma[J]. J Natl Cancer Inst，2001，93（21）：1588-1589.

[5] Ding Y，Shimada Y，Maeda M，et al. Association of CC chemokine receptor 7 with lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2003，9（9）：3406-3412.

[6] Mashino K，Sadanaga N，Yamaguchi H，et al. Expression of chemokine receptor CCR7 is associated with lymph node metastasis of gastric carcinoma[J]. Cancer Res，2002， 62（10）：2937-2941.

[7] Ishigami S，Natsugoe S，Nakajo A，et al. Prognostic value of CCR7 expression in gastric cancer[J]. Hepatogastroenterology，2007，54（76）：1025-1028.

[8] Arigami T，Natsugoe S，Uenosono Y，et al. CCR7 and CXCR4 expression predicts lymph node status including micrometastasis in gastric cancer[J]. Int J Oncol，2009，35（1）：19-24.

[9] Schaeuble K，Hauser MA，Singer E，et al. Cross-talk between TCR and CCR7 signaling sets a temporal threshold for enhanced T lymphocyte migration[J]. J Immunol，2011， 187（11）：5645-5652.

[10] Chow MT，Luster AD. Chemokines in Cancer[J]. Cancer Immunol Res，2014，2（12）：1125-1131.

[11] Cojoc M，Peitzsch C，Trautmann F，et al. Emerging targets in cancer management： role of the CXCL12/CXCR4 axis[J].Onco Targets Ther，2013，6：1347-1361.

[12] Roy I，Evans DB，Dwinell MB. Chemokines and chemokine receptors： update on utility and challenges for the clinician[J]. Surgery，2014，155（6）：961-973.

[13] Nakata B，F(xiàn)ukunaga S，Noda E，et al. Chemokine receptor CCR7 expression correlates with lymph node metastasis in pancreatic cancer[J]. Oncology，2008，74（1-2）：69-75.

[14] Ishida K，Iwahashi M，Nakamori M，et al. High CCR7 mRNA expression of cancer cells is associated with lymph node involvement in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol，2009，34（4）：915-922.

（收稿日期：2014-12-01）