微囊化胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的胰島素釋放情況觀察

王雅光　田鶴　穆長(zhǎng)征

[摘要] 目的 微囊化后胰島素產(chǎn)生細(xì)胞（IPCs）的分泌能力的觀察。 方法 分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）并傳代純化，應(yīng)用大鼠胰腺損傷提取物（RPE）進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞隨機(jī)分成微囊化組和未微囊化組；分別在1、2、3、5、10、15、20、25、30天對(duì)微囊化組、未微囊組及BMMSCs組進(jìn)行胰島素釋放的檢測(cè)。 結(jié)果 1、2、3、5天微囊化組和未微囊化組都有胰島素釋放并呈上升趨勢(shì)，兩組之間沒(méi)有明顯差異；10 d以后未微囊化組胰島素釋放量有下降的趨勢(shì)，而微囊化組在第20天胰島素的釋放量開(kāi)始下降，BM-MSCs組沒(méi)有胰島素的釋放。 結(jié)論 微囊不會(huì)影響細(xì)胞的存活，并且能夠延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間和增加細(xì)胞的分泌能力。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；胰島素產(chǎn)生細(xì)胞；微囊化

[中圖分類號(hào)] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）15-0008-03

[Abstract] Objective To study the effects of micro-capsule on the secretion capacity of insulin-producing cells（IPCs）. Methods Stem cells from originate mouse bone marrow mesenchymal were isolated，induced and purified. Rat pancreatic extract（RPE） was extracted from pancreases of rats. BMMSCs were induced by rat pancreatic extract. The induced cells were randomly divided into micro-encapsulated group and non-micro-encapsulated group. The experiment of glucose stimulation was performed to detect the level of insulin，respectively， at different time points（1， 2， 3， 5， 10， 15， 20， 25， 30 day）. Results The level of insulin secretion was increased after 1， 2， 3， 5 days of culture in micro-encapsulated IPCs and non-micro-encapsulated IPCs，but there were no significantly differences among the groups. The level of insulin secretion was declined in non-microencapsulated IPCs at 10 day，while there was no decreased in micro-encapsulated IPCs until 20 days. Conclusion The micro-capsule can promote the effect duration of IPCs，which supports the function of IPCs.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）；Insulin-producing cells（IPCs）；Micro-capsule

近年來(lái)糖尿病是影響人們健康的疾病之一，根據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)1型糖尿病患者約占10%。雖然可以使用外源性胰島素來(lái)進(jìn)行治療，但血糖還是不能被控制到理想水平。近年隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，為糖尿病的治療開(kāi)辟了一條新的途徑。研究發(fā)現(xiàn)RPE能成功地將小鼠BMMSCs誘導(dǎo)為IPCs[1]，誘導(dǎo)后的細(xì)胞毒性反應(yīng)比較低，并且這種誘導(dǎo)方法的效率也比較高。前期的實(shí)驗(yàn)中本課題組也已經(jīng)成功利用RPE將BMMSCs誘導(dǎo)成IPCs[2]。但是由于受到各種因素的影響，使IPCs的分泌時(shí)間不是很穩(wěn)定；于是我們采用了新興的微囊技術(shù)，微囊具有的半通透性且囊內(nèi)細(xì)胞的自由空間可以控制[3]；所以我們將在體外培養(yǎng)觀察微囊包裹的IPCs的胰島素分泌時(shí)間及分泌量的變化?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

于2009年3月～2011年3月期間由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的5 w齡SD大鼠（雌雄均可），由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)4～8 w齡的昆明小鼠[雌雄均可，生產(chǎn)許可SCXK（遼）2008-0005]。IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胰蛋白酶購(gòu)自Amresco公司，胎牛血清購(gòu)于Jibco公司，海藻酸鈉購(gòu)自Sigma公司，多聚賴氨酸購(gòu)自Biosharp公司，胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自上海晨易生物公司，兔抗小鼠胰島素抗體購(gòu)自北京博爾西科技公司。

1.2大鼠胰腺損失提取物的制備

取SD大鼠（5 w齡），用10%水合氯醛腹腔麻醉，切除2/3的胰腺，待48 h后處死大鼠并取出損傷的胰腺，PBS沖洗、剪碎、速凍之后加PBS在4℃高速離心以后取上清，BCA法分析上清液的蛋白含量，將檢測(cè)之后的上清液凍存、備用。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定

1.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 昆明小鼠脫頸處死以后，在無(wú)菌狀態(tài)用1 mL IMDM培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中含15% FBS、12 μM的L-谷氨酰胺、1%抗生素）沖出股骨和脛骨骨髓腔中的骨髓。離心后接種到25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（細(xì)胞密度為1×106/mL），放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待90%的細(xì)胞融合后，進(jìn)行傳代純化，此時(shí)的細(xì)胞記作P1，做誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)取P3細(xì)胞[4]。

1.3.2 誘導(dǎo)分化及鑒定 取出培養(yǎng)傳代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入50 mg/g的大鼠胰腺提取液，誘導(dǎo)分化1周后，一部分進(jìn)行雙硫腙檢測(cè)，另一部分做細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)；雙硫腙檢測(cè)在原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入雙硫腙染色工作液（10 g/L），37℃，水浴10 min后，鏡檢[5]；免疫熒光檢測(cè)取分化后的細(xì)胞，離心、固定、PBS沖洗后，封閉1 h，加一抗（兔抗小鼠胰島素抗體），室溫孵育1 h，PBS沖洗，然后加二抗（FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1 h，鏡檢[6]。

1.4 微囊化IPCs的制備

將誘導(dǎo)以后的IPCs置于1.8%海藻酸鈉溶液中，同時(shí)調(diào)節(jié)注射泵（70 mL/h）、氣流的速度（5 L/min）、海藻酸鈉濃度及液面的高度。使用氣體微囊發(fā)生器，將含有IPCs的海藻酸鈉溶液噴入100 mmol/L CaCl2溶液中，形成鈣珠以后，用多聚賴氨酸包裹（濃度為0.05%），將其用生理鹽水沖洗過(guò)后，再放入海藻酸鈉溶液（濃度為0.14%）里，再經(jīng)檸檬酸鈉處理以后就獲得了微囊化的IPCs，然后放入六孔板中培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 1.5 微囊化IPCs、未微囊IPCs及BMMSCs胰島素分泌情況的檢測(cè)

分別取BMMSCs、微囊化IPCs和未微囊化的IPCs懸液各3 mL。根據(jù)前人提出的方法[7]，刺激細(xì)胞和微囊用25 mM的葡萄糖，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別是1、2、3、5、10、15、20、25、30天。在放免儀上測(cè)定各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)（cpm）。經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理以后，計(jì)算出樣品的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，不同時(shí)點(diǎn)比較采用F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的檢測(cè)結(jié)果

原代的BMMSCs形狀大不相同，經(jīng)傳代純化后的BMMSCs形態(tài)比較規(guī)則均一，呈長(zhǎng)梭形（a）；RPE誘導(dǎo)分化后的BMMSCs經(jīng)雙硫腙檢測(cè)呈猩紅色（b），核不著色；提示細(xì)胞內(nèi)含有鋅離子，有胰島素的合成；細(xì)胞免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)有胰島素表達(dá)，呈綠色熒光（c），見(jiàn)封三圖1。

2.2不同時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞胰島素分泌結(jié)果的顯示

在25 mM葡萄糖的刺激下，微囊化的IPCs和未微囊化IPCs均隨著葡萄糖的刺激釋放胰島素，BMMSCs不分泌胰島素，15 d的未微囊化組胰島素釋放量開(kāi)始減少，25 d微囊化組胰島素釋放量開(kāi)始減少；從結(jié)果上看IPCs是具有分泌胰島素功能的，且微囊并不會(huì)影響胰島素的釋放，見(jiàn)表1。

3 討論

BMMSCs具有較強(qiáng)的多向分化功能以及自我更新的能力，屬于成體干細(xì)胞的一種[8-10]。RPE作為本實(shí)驗(yàn)所選用的誘導(dǎo)劑，是因其優(yōu)點(diǎn)較多，如成本很低、作用溫和，最主要的是胰島素分泌的量較大、細(xì)胞存活率也較高。從雙硫腙的染色和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出的IPCs與小鼠胰島細(xì)胞相比沒(méi)有差別[11]；微囊是一種半透膜，能夠使小分子物質(zhì)自由出入，同時(shí)又能阻止大分子進(jìn)入；不但能滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)需要且又不影響其功能，微囊有體積小、制作方法較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且膜內(nèi)細(xì)胞的自由空間可控制[12]；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)微囊化組、未微囊化組及BMMSCs組細(xì)胞葡萄糖刺激檢測(cè)胰島素的分泌情況顯示，第1、2、3、5天微囊化組和未微囊化組胰島素的釋放量并沒(méi)有明顯差別，10 d未微囊化細(xì)胞組胰島素釋放量開(kāi)始減少，15 d已明顯看出兩組之間的差別，未微囊化組胰島素的釋放量明顯小于微囊化組；25 d時(shí)微囊化組胰島素的釋放量也開(kāi)始有所下降，30 d時(shí)兩組胰島素釋放量均已下降，但是微囊化組胰島素的量明顯高于未微囊化組。而不經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞始終是沒(méi)有胰島素釋放的。而其他兩組經(jīng)檢測(cè)均有胰島素釋放，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)微囊化組胰島素釋放會(huì)更長(zhǎng)久一些。表明微囊不但可使細(xì)胞存活不影響胰島素釋放，且能延長(zhǎng)其存活時(shí)間，增加其胰島素釋放量。說(shuō)明微囊內(nèi)部的三維立體空間給細(xì)胞提供一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，可能由于微囊表面有很大張力，所以細(xì)胞不但能向微囊內(nèi)部擴(kuò)散，而且還可能會(huì)吸附在微囊表面，使其能夠明顯改善細(xì)胞的增殖和分泌的能力。

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（收稿日期：2015-03-19）