死亡受體DR4基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎易感性的關(guān)系

藍(lán)德云等

[摘要] 目的 探討死亡受體（DR）4基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）易感性及其臨床病理特征的關(guān)系。 方法 在147例UC患者和244名健康對照者中，采用直接測序法檢測DR4（rs20575）基因單核苷酸多態(tài)性。采用非條件Logistic回歸分析DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC的關(guān)系。 結(jié)果 與對照組比較，UC組DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯升高（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930，95%CI：1.192～12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161～8.869）。根據(jù)改良的Truelove & Witts嚴(yán)重程度分型標(biāo)準(zhǔn)將UC患者分為輕度、中度和重度。結(jié)果顯示中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率顯著高于輕度患者（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208～8.916；14.89% vs 4.00%，P=0.028，OR=4.200，95%CI：1.165～15.146）。DR4（rs20575）的突變等位基因和基因型頻率在廣泛性結(jié)腸炎和遠(yuǎn)端結(jié)腸炎之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 結(jié)論 DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC易感性密切相關(guān)，且可能影響UC的病情嚴(yán)重程度。

[關(guān)鍵詞] 死亡受體；基因多態(tài)性；潰瘍性結(jié)腸炎

[中圖分類號] R574 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）15-0004-04

[Abstract] Objective To explore the association between death receptor （DR） 4 gene polymorphism and the predisposition of ulcerative colitis （UC）. Methods DR4（rs20575） genotypes were determined by direct sequencing in a total of 147 UC patients and 244 healthy controls. Logistic regression analysis was employed to assess the relationship between DR4（rs20575）gene polymorphism and UC. Results Compared to the controls， the frequencies of variant allele（G）and genotype（CG+GG） of DR4（rs20575）were significantly increased in UC patients（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930，95%CI：1.192-12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161-8.869）. According to the Truelove & Witt Activity Index， the severity of UC was further stratified into the mild， moderate and severe disease. In result， variant allele （G）and genotype（CG+GG）in DR4（rs20575）were significantly higher in patients with moderate and severe UC than those with mild UC（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208-8.916； 14.89% vs 4.00%，P=0.028，OR=4.200，95%CI：1.165-15.146）. DR4（rs20575） mutant allele and genotype frequencies between extensive colitis and distal colitis were no statistical difference （P>0.05）. Conclusion The genetic polymorphism of DR4（rs20575） is significantly related with the susceptibility to UC， as well as severity of the disease in this cohort of Chinese patients.

[Key words] Death receptor； Gene polymorphism； Ulcerative colitis

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）是一種病因不明的直腸和結(jié)腸慢性非特異性的炎癥性疾病，病變只局限于大腸黏膜和黏膜下層。臨床主要表現(xiàn)為黏液膿血便、腹痛、腹瀉、里急后重、體重減輕和貧血等。據(jù)流行病學(xué)研究報(bào)道，我國UC的發(fā)病率約為11.6/100000，并呈逐年上升趨勢[1]。目前認(rèn)為腸上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞的凋亡缺陷可能是引起腸組織中異常免疫應(yīng)答、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。

死亡受體（death receptor，DR）4是腫瘤壞死因子（TNF）相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL）的功能性受體之一，它與TRAIL結(jié)合后，能產(chǎn)生促靶細(xì)胞凋亡信號，不僅參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視，還在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有研究證實(shí)DR4/TRAIL凋亡信號能影響多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，尤其是腫瘤和自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]、多發(fā)性硬化[4]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]等。據(jù)報(bào)道DR4介導(dǎo)的生物學(xué)功能除受自身蛋白功能和表達(dá)的影響外，還與其遺傳多態(tài)性密切相關(guān)。DR4基因位于染色體8p21-22，該區(qū)域存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點(diǎn)，其中DR4（rs20575）是亞洲人群中常見的功能性位點(diǎn)[6-10]。至今國內(nèi)外有關(guān)DR4基因多態(tài)性與UC的研究報(bào)道少見，因此本研究將在中國漢族人群中探討DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC的關(guān)系，旨在為深入闡明UC的遺傳免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2004年10月～2014年5月我院收集的住院或門診確診的UC患者147例，其中男75例，女72例，平均年齡（40.06±13.84）歲。根據(jù)2012年中華醫(yī)學(xué)會發(fā)表的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》，經(jīng)過組織病理學(xué)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、電子結(jié)腸鏡、影像學(xué)檢查等綜合確立UC診斷。根據(jù)蒙特利爾分類標(biāo)準(zhǔn)將UC患者分為廣泛結(jié)腸炎和遠(yuǎn)端結(jié)腸炎。采用Truelove&Witts分型標(biāo)準(zhǔn)將UC患者分為輕度、中度和重度。對照組均來自泰順縣人民醫(yī)院體檢中心收集的健康體檢者，共244例，其中男130例，女114例，平均年齡（41.12±14.76）歲。所有研究對象在納入實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)各項(xiàng)臨床檢查排除腫瘤、感染性疾病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。所有研究對象均為無血緣關(guān)系的漢族人群，納入實(shí)驗(yàn)前均簽署知情同意書。本研究取得本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1全基因組DNA提取 所有研究的對象均抽取空腹外周靜脈血約5 mL，置于乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）抗凝管中，采用Promega公司生產(chǎn)的試劑盒提取全血基因組DNA，后者稀釋至10 ng/μL后置于-20℃凍存。

1.2.2直接測序法檢測DR4（rs20575）基因多態(tài)性 ①引物設(shè)計(jì)：DR4（rs20575）的引物由Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。其引物序列如下：（F：5GGGCTGATAGATACGGGTACAAGGA3；R：5ACCACGACCAGGAACACAGCAT3），②PCR擴(kuò)增及純化：PCR總反應(yīng)體系10 μL，包括1 μL全基因組DNA，0.5U FastTaq酶（Roche公司），1 μL dNTP （Promega公司），1 μL的10×PCR緩沖液及適量無核酸酶去離子水。循環(huán)條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取2 μL PCR產(chǎn)物，加入1.5U蝦堿性磷酸酶（SAP）和2U外切酶（Exon I），擴(kuò)容至7.4 μL，置于37℃ 80 min，85℃ 15 min，4℃保存。③測序反應(yīng)以及上機(jī)、純化：測序反應(yīng)總體系6 μL，包括3 μL PCR純化產(chǎn)物，0.4 μL Bigdye （ABI公司），1.2 μL 5×buffer緩沖液，0.4 μL正向引物（10 μmol/L）和適量去離子水。循環(huán)條件：96℃ 1 min，96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 4 min，共25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物中加入醋酸鈉和無水乙醇混合物并離心，最后往96孔板中每孔中加入8 μL HiDi（甲酰胺，ABI公司），經(jīng)ABI 3730遺傳分析儀平臺進(jìn)行測序分析，獲取數(shù)據(jù)后經(jīng)GeneMapper 4.0軟件（ABI公司）分析判讀基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包處理。分別用χ2檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較組間性別、年齡差異。DR4基因型和等位基因的分布用頻數(shù)（率）來表示，其中等位基因頻數(shù)=純合子基因頻數(shù)×2+雜合基因頻數(shù)。采用χ2分析檢驗(yàn)DR4基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。經(jīng)校正年齡、性別后，采用非條件Logistic回歸分析比較DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC易感性及臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 一般資料

147例UC患者中，采用蒙特利爾分類，直腸、左半結(jié)腸炎（E1+E2）和廣泛結(jié)腸炎（E3）分別為82例（55.78%）和65例（44.22%）；以改良的Truelove & Witts嚴(yán)重程度分型標(biāo)準(zhǔn)[12]為依據(jù)，輕度100例（68.03%），中度31例（21.09%），重度16例（10.88%）；吸煙者57例（38.78%），不吸煙及已戒煙者90例（61.22%）。治療上采用柳氮磺吡啶或5-氨基水楊酸117例（79.59%），潑尼松51例（34.69%），抗生素36例（24.49%），免疫抑制劑2例（1.36%）。UC組與對照組在年齡、性別構(gòu)成比方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。

2.2 DR4基因多態(tài)性在UC組和對照組之間的分布

對照組中經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DR4（rs20575）的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律（P>0.05）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，UC組DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率均明顯升高（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930， 95%CI：1.192～12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161～8.869），而DR5（rs1047266）的突變等位基因和基因型頻率在UC組與對照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05），見表1。

2.3 DR4基因多態(tài)性與UC疾病嚴(yán)重程度和病變范圍的關(guān)系

根據(jù)Truelove&Witts分型標(biāo)準(zhǔn)將UC分為輕度和中重度，結(jié)果顯示DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯高于輕度患者（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208～8.916；14.89% vs 4.00%，P=0.028， OR=4.200，95%CI：1.165～15.146）（表2）。而DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC患者的疾病部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（P均>0.05），見表3。

3討論

TRAIL受體家族包括2種死亡受體DR4、DR5， 2種誘騙受體DcR1、DcR2及護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）。理論上，DR4含有功能性死亡結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞表面的DR4與游離TRAIL發(fā)生結(jié)合后，將激活細(xì)胞內(nèi)FADD和Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。而誘騙受體不含功能性死亡結(jié)構(gòu)，與TRAIL結(jié)合后不產(chǎn)生凋亡信號，卻能競爭性削弱TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)[11]。研究證實(shí)TRAIL介導(dǎo)的凋亡信號除受多種細(xì)胞因子和微生物因素影響外，還與其受體的遺傳多態(tài)性密切相關(guān)，尤其是死亡受體。

DR4基因全長33 kb，含10個(gè)外顯子，其中（rs20575）位于外顯子4，負(fù)責(zé)編碼的氨基酸位于細(xì)胞外富含半胱氨酸的區(qū)域，是DR4與TRAIL特異性結(jié)合的部位。研究證實(shí)若該位點(diǎn)野生型等位基因C突變?yōu)镚，所編碼的蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，可能使受體-配體結(jié)合部位發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致DR4與TRAIL結(jié)合缺陷，從而可能影響TRAIL凋亡途徑的正常啟動[12]。鑒于DR4/TRAIL介導(dǎo)的凋亡信號參與多種腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，DR4基因多態(tài)性可能與疾病易感性密切相關(guān)。例如，來自高加索人群的研究報(bào)道，DR4（rs20575）基因突變會增加頭頸部鱗癌發(fā)生的危險(xiǎn)性[13]，但卻能降低套細(xì)胞淋巴瘤[14]和膀胱癌[15]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但另有一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示DR4（rs20575）基因多態(tài)性對卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的易感性無顯著影響[16]。此外，DR4（rs20575）基因多態(tài)性被證實(shí)與日本人群胃癌的易感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)[10]。推測上述結(jié)論差異的原因可能是由于不同種族人群間的遺傳背景差異所致。

本研究中，雖然DR4（rs20575）的突變等位基因G的頻率（1.23%）在對照組中偏低（表1），但與數(shù)據(jù)庫中千人基因組計(jì)劃所報(bào)道的中國人群最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）基本相符（北方漢族MAF：2.58%，南方漢族MAF：2.50%）。參考國內(nèi)外現(xiàn)有的研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)DR4（rs20575）基因多態(tài)性存在明顯的種族差異，高加索人群中該位點(diǎn)的突變率較高[13，14]，而亞洲人群中則較低[10]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，UC組中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯升高。中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率顯著亦顯著高于輕度患者。我們的研究結(jié)果提示DR4基因多態(tài)性可能與中國漢族人群UC密切相關(guān)，DR4基因突變不僅能影響UC易感性，還與UC疾病嚴(yán)重度密切相關(guān)。推測其機(jī)制可能是DR4基因突變后導(dǎo)致DR4功能或活性異常，直接或間接影響DR4信號的促細(xì)胞凋亡作用。近年來，已有研究證實(shí)TRAIL/DR4的凋亡信號參與體內(nèi)先天和后天免疫功能調(diào)節(jié)，但該信號通路異常導(dǎo)致UC發(fā)病機(jī)制的潛在影響仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL/DR4既能影響Th1/Th2細(xì)胞極化[17]，還與Treg細(xì)胞的分化密切相關(guān)[18]。TRAIL與其受體結(jié)合后通過NF-кB途徑調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的釋放[19]，而NF-кB是影響T細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，提示TRAIL在幼稚CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化過程中具有重要功能[20，21]。另據(jù)報(bào)道，Th17細(xì)胞對包括TRAIL在內(nèi)的TNF家族成員所誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)幾乎均存在抵抗。

總之，本研究提示DR4（rs20575）基因多態(tài)性與UC易感性密切相關(guān)，并且還可能影響UC的病情嚴(yán)重程度。由于DR4信號通路的影響因素紛繁復(fù)雜，涉及DR4蛋白的表達(dá)和功能及其配體TRAIL功能的影響，并且至今有關(guān)該通路對機(jī)體免疫系統(tǒng)的潛在影響仍未完全闡明，因此本研究尚不能完全詮釋該信號影響UC發(fā)病的潛在機(jī)制，這將是我們后續(xù)研究亟待解決的問題。

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（收稿日期：2015-03-26）