銀杏葉提取物對(duì)慢性低O₂高CO₂大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

陳松芳等

[摘要] 目的 探討銀杏葉提取物對(duì)慢性低O2高CO2大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的變化及影響。 方法 建立慢性低O2高CO2大鼠肺動(dòng)脈高壓模型。將SD大鼠72只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、慢性低O2高CO2 4周組（4HH組）、慢性低O2高CO2 4周組+EGb高劑量（100 mg/kg）組[4HH+EGb（H）組]、慢性低O2高CO2 4周組+EGb低劑量（50 mg/kg）組[4HH+EGb（L）組]；大鼠空間學(xué)習(xí)記憶檢測(cè)，采用經(jīng)典Morris水迷宮結(jié)合跳臺(tái)作業(yè)。 結(jié)果 4HH組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力下降明顯，表現(xiàn)為游泳逃避潛伏期及游泳總距離延長(zhǎng)，跳臺(tái)作業(yè)錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；銀杏葉提取物不同劑量干預(yù)組[4HH+EGb（H）組、4HH+EGb（L）組]逃避潛伏期及游泳總距離縮短，跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)減少。 結(jié)論 銀杏葉提取物對(duì)慢性低O2高CO2大鼠空間學(xué)習(xí)記憶下降有改善或提高作用。

[關(guān)鍵詞] 慢性低O2高CO2；銀杏葉提取物；行為學(xué)；Morris水迷宮

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）15-0001-03

[Abstract] Objective To observe changes of spatial learning-memory in rats with chronic hypoxic hypercapnia and the effect of gingkgo biloba extra. Methods After established the rat model of chronic hypoxic hypercapnia，seventy-two rats were randomly divided into four groups： normal control （NC），hypoxic-hypercapnia 4-week （4HH），hypoxic-hypercapnia 4-week+gingkgo biloba extra （EGb） high dose （100 mg/kg） group[4HH+EGb（H）] and hypoxic-hypercapnia 4-week+EGb low dose （50 mg/kg） group[4HH+EGb（L）]. Praxiology in rats was asessed by the Morris water maze and step down test. Results The spatial learning-memory in rats exposed to chronic hypoxic-hypercapnia 4-week（4HH group）were displayed significant impairment in their performance，the longer mean escape latencies and swim path distances，the more error times. 4HH+EGb（H） and 4HH+EGb（L）groups shortened the reaction time of leaning， prolonged the latent time of memory， reduced times of mistakes. Conclusions EGb can enhance the capacity of learning-memory in the rats exposed chronic hypoxic hypercapnia.

[Key words] Chronic hypoxic hypercapnia； Gingkgo biloba extra； Praxiology； Morris water maze

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一類常見病和多發(fā)病，存在著很高的發(fā)病率和死亡率。近來許多研究相繼報(bào)道了COPD 引起的認(rèn)知損害，而且該類損害并非只是巧合或抑郁引起[1]。由于慢性低O2高CO2模型很好地模擬了COPD的病理生理學(xué)改變，使之成為研究肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制和臨床防治的理想工具，然而眾多研究?jī)H關(guān)注肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展機(jī)制上，而對(duì)認(rèn)知行為功能影響的關(guān)注較少。銀杏（ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬植物，其主要有效成分為黃酮類和萜內(nèi)脂類，具有擴(kuò)張血管、保護(hù)機(jī)體組織和抗氧化等作用，從而臨床有用于缺血性腦血管病的治療[2，3]。而其對(duì)COPD認(rèn)知功能的影響未見報(bào)道。因此本研究擬通過建立慢性低O2高CO2肺動(dòng)脈高壓模型及銀杏葉提取物（gingkgo biloba extra，EGb）干預(yù)后，觀察動(dòng)物行為學(xué)的改變。為臨床銀杏葉提取物對(duì)認(rèn)知功能的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

常壓慢性低O2高CO2實(shí)驗(yàn)?zāi)M艙（濰坊華信氧業(yè)有限公司）、M192519便攜式O2和CO2氣體測(cè)定儀（上海牧晨電子技術(shù)有限公司）、大鼠跳臺(tái)儀、Morris 水迷宮（上海贊德醫(yī)療有限公司）、Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

將72只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～220 g（由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，wydy 2012-0079），根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，分為四組：正常對(duì)照組（常壓常氧組/NC組），低O2高CO2 4周組（4HH組），低O2高CO2 4周組+EGb低劑量（50 mg/kg）組[4HH+EGb（L）組]、低O2高CO2 4周組+EGb高劑量（100 mg/kg）組[4HH+EGb（H）組]，每組隨機(jī)抽取8只。參考文獻(xiàn)[1]的方法，將后三組大鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)，艙內(nèi)O2濃度使其降低并維持在9%～11%（根據(jù)便攜式 O2和CO2氣體測(cè)定儀結(jié)果，通過N2調(diào)節(jié)），CO2濃度為6%～7%，進(jìn)艙時(shí)間為每天早上8：00～16：00，每周6 d。動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后， 用戊巴比妥鈉（35 mg/kg BW）腹腔麻醉，右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈（mPAP）、平均頸動(dòng)脈壓（mCAP）。銀杏葉片（商品名：舒血寧片）：每片含銀杏葉提取物50 mg（廣西半宙制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20064166）。模型+銀杏葉提取物組每天進(jìn)艙前30 min灌服銀杏葉混懸液，對(duì)照組、模型組均按灌服等量0.9%生理鹽水。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1 Morris水迷宮 Morris水迷宮由圓形水池、圓柱形平臺(tái)、攝像頭記錄及軟件分析系統(tǒng)4部分組合而成。圓形水池是一個(gè)直徑170 cm、高40 cm 的鐵皮圓桶，池壁內(nèi)側(cè)用白色泡沫紙粘貼。水池分成4個(gè)象限，水溫（25±1）℃，將站臺(tái)固定置于第2象限中央，浸沒于水下2 cm，撒入適量墨汁水變?yōu)椴煌该鳡睿靡噪[蔽水中的平臺(tái)。池壁上懸掛兩個(gè)以上物體作為近距離視覺參照物，并在水池外房間內(nèi)有多種遠(yuǎn)距離視覺參照物。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d，每天上下午固定時(shí)間段兩次訓(xùn)練。大鼠按順序從4個(gè)等分象限的中點(diǎn)面向池壁放入池中，記錄大鼠水中活動(dòng)軌跡（攝像頭）并計(jì)算其爬上平臺(tái)時(shí)間，期間如超過120 s未找到平臺(tái)，終止該象限檢測(cè)，潛伏期記錄為120 s。待大鼠平臺(tái)上休息30 s再行下一象限檢測(cè)。用平均逃避潛伏期（mean escape latency）和游泳總距離（swim path distance）兩個(gè)參數(shù)反映大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。

1.3.2 跳臺(tái)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置主要由回避反應(yīng)箱（30 cm×30 cm×30 cm）及一圓形跳臺(tái)組成。其中箱底為銅柵，可通刺激電流（0.5～0.6 mA）。圓形跳臺(tái)可隨機(jī)置于銅柵上，大鼠可在跳臺(tái)上停留以回避電擊。在實(shí)驗(yàn)前為消除大鼠探究反應(yīng)，需先將其放置于箱內(nèi)，適應(yīng)3 min。在訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)期間，多數(shù)動(dòng)物受電擊后，可能再次或多次跳至銅柵上，而后又重新跳回平臺(tái)。每次訓(xùn)練5 min，記錄大鼠訓(xùn)練時(shí)跳下臺(tái)受電擊次數(shù)，即第一次錯(cuò)誤（EN1），作為訓(xùn)練成績(jī)。24 h后以此作為記憶保持實(shí)驗(yàn)，記錄每只動(dòng)物3 min內(nèi)跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)，即第二次錯(cuò)誤次數(shù)（EN2），并且第一次跳下平臺(tái)的潛伏期（ST）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形成表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（F 檢驗(yàn)），均數(shù)兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各大鼠mPAP、mCAP的變化

與NC組比較，4HH組及不同劑量EGb干預(yù)組mPAP有顯著性差異（P均<0.01），而mCAP無顯著性差異（P>0.05），見表1。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮成績(jī)

與NC對(duì)照組比較，4HH組平均逃避潛伏期延長(zhǎng)和游泳總距離增加。EGb干預(yù)組（高劑量、低劑量）平均逃避潛伏期和游泳總距離均縮短，與4HH組比較，有顯著性差異（P<0.05），見表2。

2.3各組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

與NC組比較，4HH組潛伏期明顯縮短，EN1及EN2錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加（P<0.01）。EGb高劑量干預(yù)組與4HH組相比，潛伏期延長(zhǎng)，EN1及EN2錯(cuò)誤次數(shù)減少，均有顯著性差異（P<0.01）。見表3。

3 討論

銀杏（ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬植物，其主要有效成分為黃酮類和萜內(nèi)脂類。根據(jù)現(xiàn)代的藥理學(xué)分析研究，EGb具有廣泛的生物藥理效應(yīng)，如拮抗血小板凝聚、保護(hù)血管內(nèi)膜、抑制微血栓形成、清除自由基等作用[2-4]。近年來的臨床療效觀察也發(fā)現(xiàn)EGb可明顯改善血管性癡呆患者的智能障礙，并認(rèn)為該作用可能通過促進(jìn)海馬NR1受體蛋白及mRNA表達(dá)，而抑制興奮性氨基酸的釋放及鈣超載，促進(jìn)血管性癡呆大鼠海馬組織鈣調(diào)素、鈣調(diào)素激酶Ⅱ表達(dá)的作用相關(guān)[5、6]。此外，也有進(jìn)一步的相關(guān)研究提示，EGb能加速神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，對(duì)突觸的傳遞產(chǎn)生易化作用，對(duì)信息加工、記憶的鞏固和再現(xiàn)密切相關(guān)[7，8]。而EGb對(duì)于慢性低O2高CO2導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的干預(yù)作用，未見報(bào)道。

近年來許多研究相繼報(bào)道了COPD 引起的認(rèn)知損害，而且該類損害并非只是巧合或抑郁引起[9]。尸檢和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)存在這類認(rèn)知障礙的患者或動(dòng)物的海馬區(qū)研究中發(fā)現(xiàn)了不同程度的損傷[10]。相對(duì)于國(guó)外單純低O2性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，慢性低氧高二氧化碳模型很好地模擬了COPD 的病理改變[11]。本研究結(jié)果也表明，各模型組大鼠與正常對(duì)照組相比，mPAP明顯升高，而mCAP無顯著性差異，說明慢性低氧高二氧化碳肺動(dòng)脈高壓模型已復(fù)制成功，且動(dòng)物的體循環(huán)壓無明顯變化，提示模型組動(dòng)物腦血流未受明顯影響。

在現(xiàn)代學(xué)習(xí)記憶研究中，Morris水迷宮往往被認(rèn)為是非自我為中心的、空間參照的學(xué)習(xí)記憶研究可靠的理想的經(jīng)典測(cè)試工具[12]，但是由于動(dòng)物在水中的本能逃生反應(yīng)，且在游泳中消耗能量較大，從而影響學(xué)習(xí)記憶的檢測(cè)。故此，本研究為了試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定可靠，同時(shí)結(jié)合跳臺(tái)作業(yè)實(shí)驗(yàn)。后者優(yōu)點(diǎn)在于可較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物空間的辨別性學(xué)習(xí)記憶能力， 簡(jiǎn)便易行，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)備的不同，一次可同時(shí)試驗(yàn)多只動(dòng)物，可實(shí)現(xiàn)組間平行操作。在該實(shí)驗(yàn)中同時(shí)采用了跳臺(tái)潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)等指標(biāo)，排除了藥物非特異性干擾，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說服性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，兩個(gè)測(cè)試工具實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相平行。模型組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力均下降，而EGb干預(yù)（高、低劑量組）后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有不同程度的提高，表現(xiàn)為平均逃避潛伏期和游泳總距離縮短、EN1及EN2錯(cuò)誤次數(shù)減少。同時(shí)我們?cè)趦蓚€(gè)劑量組間，未發(fā)現(xiàn)EGb在（50～100）mg/kg劑量區(qū)間，呈現(xiàn)干預(yù)作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示后續(xù)的該藥物量效研究上劑量區(qū)間可能需進(jìn)一步擴(kuò)大。

當(dāng)然，動(dòng)物在該造模環(huán)境下也可能出現(xiàn)一些生理變化，如：睡眠結(jié)構(gòu)的紊亂、體重、腦血流的變化，從而影響空間學(xué)習(xí)記憶能力等[13，14]。在本研究中，我們根據(jù)各組體重的改變及造模動(dòng)物的mCAP的檢測(cè)，可以排除體重及腦血流改變的影響。因?qū)嶒?yàn)技術(shù)條件約束，在本研究中未能采用視頻監(jiān)測(cè)，直觀地觀察實(shí)驗(yàn)因素：慢性低O2高CO2，對(duì)大鼠睡眠結(jié)構(gòu)的影響。然而有研究[15]認(rèn)為，慢性低O2對(duì)動(dòng)物睡眠沒有長(zhǎng)期的影響，其在單純間斷低O2條件下，該研究通過皮層埋植的腦電圖（EEG）監(jiān)測(cè)動(dòng)物的睡眠結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)慢性低氧環(huán)境下，第一天大鼠睡眠結(jié)構(gòu)明顯紊亂，總睡眠時(shí)間顯著減少，其中以非快動(dòng)眼睡眠相（NREM）縮短更加明顯。但單純間斷低O2環(huán)境下第二日開始，大鼠的睡眠時(shí)間逐漸恢復(fù)，非快動(dòng)眼睡眠相（NREM）和快動(dòng)眼睡眠相（REM）逐步延長(zhǎng)，第3～4天恢復(fù)到正常。

綜上所述，說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在該造模環(huán)境下的一些生理反應(yīng)是穩(wěn)定的或變化甚微，也提示其不是導(dǎo)致模型組學(xué)習(xí)記憶能力下降主要因素。

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（收稿日期：2015-01-26）