應(yīng)用實時熒光RT—PCR法檢測水產(chǎn)品中諾如病毒

紀衍瑾 孫雯雯 祝喆 楊松濤

[摘要] 目的 建立水產(chǎn)品樣品中的諾如病毒檢測方法。 方法 優(yōu)化甘氨酸緩沖液處理水產(chǎn)品勻漿液，摸索PEG沉淀濃縮病毒的濃度，提取病毒RNA，采用熒光定量RT-PCR方法進行諾如病毒檢測。 結(jié)果 應(yīng)用優(yōu)化后的方法檢測72份樣品，并用核苷酸序列測定法對陽性PCR產(chǎn)物進行驗證，所得陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)核苷酸序列測序證實為諾如病毒。 結(jié)論 本研究方法可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中的諾如病毒檢測，撫順市海鮮市場上的水產(chǎn)品很少存在諾如病毒的污染。

[關(guān)鍵詞] 諾如病毒；水產(chǎn)品；富集；熒光定量RT-PCR

[中圖分類號] R450 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）19-0130-03

諾如病毒（norovirus，NoV）是引起兒童急性胃腸炎的主要誘因，可出現(xiàn)食物腹瀉、嘔吐、頭痛、腹痛和發(fā)熱等中毒癥狀，在世界公共衛(wèi)生安全中嚴重威脅著人類的生命安全[1]。最初，在檢測諾如病毒的過程中，檢測方法有很大的局限性，人們對諾如病毒對人類所能造成的影響和危害缺少正確的認識，并且低估了諾如病毒所能造成的危害性。

諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，呈球形，無包膜，可通過人-人直接接觸傳播、食物性傳播（生吃海產(chǎn)品尤為主要）、水源性傳播等多種傳播途徑傳播[3]。諾如病毒有高度的變異性，在同一時期、同一地區(qū)就可能存在不同遺傳特性的毒株。諾如病毒抗體保護力弱，不能實現(xiàn)長期免疫保護，所以非常易造成反復(fù)感染。食品和飲料很容易被諾如病毒感染，100個病毒就能造成人們發(fā)病。諾如病毒在體外很難繁殖，如果一遇到食品和水，極易引起人們發(fā)病。當(dāng)人們生食或食用加熱不徹底的貝類時，也可能受到感染，近年來有很多外國媒體已報道，許多胃腸炎暴發(fā)疫情都與生吃牡蠣等貝類食物有關(guān)[3，4]。另外，有些產(chǎn)品比如色拉和冰凍水果也可能在來源地被污染，進而引起人們發(fā)病。2012年，德國有1萬多名小學(xué)生和托兒所的兒童在學(xué)校疑似吃了中國進口的冷凍草莓而發(fā)生食物中毒。后來，由羅勃特科赫研究院在一包草莓樣品中檢測到可引起非細菌性胃腸炎的諾如病毒[5]。由于諾如病毒在食物中含量很低，因此，在檢測各類樣品時，還應(yīng)考慮到諾如病毒感染樣品的復(fù)雜性、病毒的高度變異性和混合感染等因素，尤其是在對蛋白、脂類等PCR反應(yīng)抑制物含量高的食品樣品的前處理上以及檢測混合感染的細菌或其它病毒、濃縮低含量樣品、降低假陽性率等方面要多加注意，確保實驗結(jié)果的科學(xué)性和可靠性[6-8]。

1 材料與方法

1.1樣品的運輸與保存

標(biāo)本采集后確保在2 h內(nèi)完成轉(zhuǎn)運，運輸過程中使用冰袋進行冷藏，使樣品所處溫度在0℃～5℃。病毒在4℃保存不可超過3 d，因而實驗室收到樣品后應(yīng)盡快進行檢測，如不能及時進行檢測，需將樣品置于-20℃保存，如能置于-70℃超低溫冰箱中冷凍保存最好。

1.2 儀器與試劑

NuAire NU425-400E Ⅱ級生物安全柜（美國），貝克曼Microfuge22R冷凍離心機（美國），ABI 7500Fast全自動實時熒光定量PCR儀（美國），海爾低溫冰箱，Heidolph漩渦振蕩器（德國），RNeasy Mini Kit核酸提取盒（德國QIAGEN公司），1.5 mL無核酸離心管，甘氨酸緩沖液，PEG8000，組織勻漿器（美國Thremo公司），100～1000 μL可調(diào)移液器。

1.3病毒提取的預(yù)處理（病毒的富集）

無菌取樣，在5 g檢樣中加入35 mL甘氨酸緩沖液（樣品重量與緩沖液體積之比為1∶7）；組織勻漿器中高速勻漿3 min，充分破碎混勻；將所有均質(zhì)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，37℃孵育30 min或室溫下振蕩30 min；4℃，10000×g離心30 min；取上清，加入10 mL氯仿，充分振搖，放置10 min，中間振搖一次，4℃，10000×g離心30 min；取上清至另一清潔的100 mL離心管中，加入等體積的PEG 8000溶液（PEG終濃度為8%），上下顛倒離心管以充分混勻；冰?。罕戏胖弥辽? h，4℃，10000×g離心5 min。棄去上清，保留沉淀。

1.4 實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系

本實驗采用實時熒光RT-PCR方法進行檢測，RT-PCR 反應(yīng)體系采用中山達安基因生物公司的商品化病毒核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法GⅡ型），PCR反應(yīng)操作流程嚴格按照試劑盒使用說明書進行。本試劑盒適用于諾沃克病毒GⅡ型的病毒核酸檢測。體系配制參考試劑說明書。反應(yīng)條件：50℃，15 min，1個循環(huán)→95℃，15 min，1個循環(huán)→94℃，15 s，55℃，45 s（收集熒光），45個循環(huán)。

1.5 判定標(biāo)準

以試劑提供的諾如病毒陽性質(zhì)控品為陽性對照，以試劑提供的陰性質(zhì)控品作為陰性對照。所檢測樣品的Ct值≤30時，且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，則測定結(jié)果有效，可直接報告樣品為陽性；若3035時，可報告樣品為陰性。

2 結(jié)果

通過檢測2014年1～12月期間撫順市各水產(chǎn)品經(jīng)銷處貝類樣品72份，對實時熒光PCR反應(yīng)結(jié)果進行分析，可以發(fā)現(xiàn)陽性對照的Ct值為19且曲線有明顯對數(shù)增長期，而所采集的樣品的檢測結(jié)果均無擴增曲線，所采集樣品中未發(fā)現(xiàn)GⅡ型諾如病毒呈陽性的樣品。以1月份所采集樣品的PCR檢測結(jié)果為例見圖1，檢測數(shù)據(jù)見表1。

圖1 2014年1月所采集樣品檢的測結(jié)果

將該方法應(yīng)用于2014年1～12月從撫順市海鮮市場上購買的72份海產(chǎn)品（包括牡蠣46份、生蠔10份、扇貝8份、蟶子8份）樣本檢測，所檢測樣品中無GⅡ型諾如病毒陽性樣品，陽性對照有明顯的擴增曲線，說明該方法可應(yīng)用于海產(chǎn)品樣品中諾如病毒的核酸檢測，也提示撫順市海鮮市場上的海產(chǎn)品很少存在諾如病毒的污染。

3 討論

諾如病毒可通過多種途徑傳播，是成人、嬰幼兒以及兒童發(fā)生急性胃腸炎的主要病原之一[6]?！爸Z如病毒”感染性腹瀉屬于自限性疾病，沒有疫苗和特效藥物，公眾搞好個人衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和飲水衛(wèi)生是預(yù)防本病的關(guān)鍵，要養(yǎng)成勤洗手、不喝生水、生熟食物分開、避免交叉污染等健康生活習(xí)慣。目前，科學(xué)家已對上百種諾如病毒進行基因測序[9]。本研究結(jié)果表明，出現(xiàn)的地區(qū)不同，流行時間不同的諾如病毒基因序列比較保守一些。許多流行病學(xué)研究提示GⅡ型諾如病毒在急性胃腸炎感染中占主要地位，并且GⅡ4型為最常見，而GⅡ4/2006b型是目前的流行株[10-12]。

Jiang X的研究團隊在1992年成功研究出檢測諾如病毒的RT-PCR方法。目前諾如病毒的檢測方法主要是ELISA法、常規(guī)RT-PCR法和實時熒光定量RT-PCR法[13]。如今，常規(guī)RT-PCR技術(shù)易于操作，靈敏度較高，是目前檢測諾如病毒應(yīng)用最廣泛的方法，被稱為檢測諾如病毒的“金標(biāo)準”。有學(xué)者所用引物為RNA多聚酶區(qū)的JV12/JV13，并對模擬水樣進行檢測。結(jié)果表明，RT-PCR產(chǎn)物長度為327 bp，在模擬水樣中檢測靈敏度為200 ng/L，該實驗所建立的方法對水質(zhì)控制起到了很好的監(jiān)測作用。目前，運用ELISA法已上市的諾如病毒檢測試劑盒有IDEIATM Norovirus 試劑盒、Ridascreen Norovirus等。試劑盒相對于PCR技術(shù)更加簡單方便，但由于存在抗體抗原的特異性，該方法可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[14，15]。實時熒光RT-PCR技術(shù)敏感性較高，較常規(guī)RT-PCR省時，逐漸取代了常規(guī)PCR技術(shù)。同時，也可用于監(jiān)測水體及貝類中的諾如病毒，保障公共食品衛(wèi)生安全。

本次實際樣本的檢測全部為諾如病毒陰性，可能是海產(chǎn)品帶毒率低，也可能與采樣的時間、采樣溫度及樣品量有關(guān)，需要我們進一步進行系統(tǒng)監(jiān)測，以深入了解諾如病毒的分子流行病學(xué)特征，傳播的來源、途徑及污染的高危食物，為預(yù)防和控制諾如病毒的爆發(fā)和流行提供科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 夏體嬌，金敏，陳照立，等. 熒光定量RT-PCR檢測諾如病毒基因Ⅱ型方法的建立和評估[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，31（3）：200-203.

[2] 李志凱，蘇國成，蘇文金，等. 諾如病毒檢測方法研究進展[J]. 微生物學(xué)通報，2014，41（7）：1417-1424.

[3] Westrell T，Dusch V，Ethelberg S，et al. Norvirus out breaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.Norway，F(xiàn)tamee，Sweden and Denmark，2010[J]. Euro Surveill，2010， 15（12）：1-4.

[4] Jin M，Xie HP，Duan ZJ，et al. Emergence of the GⅡ4/2006b Variant and Recombinant Noroviruses in China[J].Journal of Medical Virology，2008，80：1997-2004.

[5] 邱楊，趙麗，盧小雨，等. 諾沃克病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國動物檢疫，2012，29（12）：29-31.

[6] 馮徵宏，肖勇，管紅霞，等. 無錫一起諾如病毒感染性腹瀉病原基因測序分析[J]. 環(huán)境與健康雜志，2012，29（4）：342-344.

[7] 張殿香，李長利，田春芳. 諾如病毒腹瀉疑似醫(yī)院感染暴發(fā)的調(diào)查分析與控制[J]. 中國醫(yī)刊，2012，47（1）：57-59.

[8] Koh SJ，Cho HG，Kim BH，et al. An outbreak of gastroenteritis caused by norovinis-contaminated at a waterpark in Korea[J]. J Korean Med Sci，2011，26（1）：28-32.

[9] 呂虹，高志勇，張國軍，等. 諾如病毒性胃腸炎快速檢測方法的研究[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，33（2）：148-152.

[10] 聞棟，顧朝陽，祖榮強，等. 一起諾如病毒致胃腸炎暴發(fā)疫情調(diào)查[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，23（5）：4-7.

[11] 王毅謙，石晶，吳福平，等. GⅠ和GⅡ諾如病毒雙重?zé)晒釸T-PCR法檢測[J]. 中國公共衛(wèi)生，2013，29（4）：599-602.

[12] 蘭玲，王濤. 熒光RT-PCR與普通RT-PCR檢測技術(shù)的比較[J]. 新疆畜牧業(yè)，2012，（3）：34-35.

[13] 李博，陳輝，鐘紅霞，等. 一起由諾如病毒感染引起的感染性腹瀉暴發(fā)疫情RT-PCR檢測[J]. 河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，24（3）：207-209.

（收稿日期：2015-04-02）