皮膚病理性瘢痕及Smad蛋白和基因的表達(dá)情況

張艷勝 嵇冰

[摘要] 目的 觀察皮膚病理性瘢痕及Smad蛋白和基因的表達(dá)情況。 方法 所有標(biāo)本來源于2010年4月～2014年4月在我院行瘢痕切除患者和招募的正常志愿者共136例，其中瘢痕疙瘩組47例，增生性瘢痕組44例，正常皮膚組共45例，對所有標(biāo)本行RT-PCR及流式細(xì)胞學(xué)檢測并分析檢測結(jié)果。 結(jié)果 從Smad3、TGF-β1基因及其表達(dá)情況來看，瘢痕疙瘩組和增生性瘢痕組均高于正常皮膚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 Smad3和TGF-β1的表達(dá)是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的重要特征。

[關(guān)鍵詞] 病理性瘢痕；皮膚；Smad；TGF-β1

[中圖分類號] R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）19-0008-04

病理性瘢痕是皮膚常見的疾病之一，是創(chuàng)傷后機(jī)體異常修復(fù)的結(jié)果，根據(jù)臨床癥狀的不同，分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕的發(fā)生與成纖維細(xì)胞的異常增生、膠原蛋白的大量沉積有關(guān)，體外實驗證實TGF-β1/Smad信號通路對成纖維細(xì)胞的增殖、膠原蛋白的合成有重要作用，但是對于病理性瘢痕的活體標(biāo)本研究報道并不多，因此本研究擬對皮膚病理性瘢痕的TGF-β1/Smad信號通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行檢測觀察，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有標(biāo)本來源于2010年4月～2014年4月在我院行瘢痕切除患者和招募的正常人共136例，其中男70例，女66例，年齡34～48歲，（41.11±6.74）歲，標(biāo)本來源的部位分別為頭面部38例，上肢60例，下肢38例。瘢痕疙瘩組47例，男26例，女21例，年齡35～48歲，（40.87±6.81）歲，標(biāo)本來源的部位分別是頭面部11例，上肢23例，下肢13例；增生性瘢痕組44例，男21例，女23例，年齡34～48歲，（41.57±6.99）歲，標(biāo)本來源的部位分別是頭面部13例，上肢18例，下肢13例；正常皮膚組共45例，男23例，女22例，年齡35～48歲，（41.03±6.41）歲，標(biāo)本來源的部位分別是頭面部14例，上肢19例，下肢12例。所有患者病例資料完整，知情同意參加研究，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合病理性瘢痕診斷標(biāo)準(zhǔn)。②患者無其他皮膚疾病。③患者無嚴(yán)重器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于60歲的患者。②不能配合瘢痕切除或皮膚取材的患者。③使用免疫抑制劑、激素患者。④使用放射性治療、化療患者。

1.2 病理性瘢痕診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]

①瘢痕疙瘩是在皮膚受損修復(fù)時，瘢痕生長范圍超過皮損范圍，向四周皮膚持續(xù)性浸潤生長，發(fā)病超過12個月，有高于表皮的規(guī)則皮膚贅生物，蟹足狀生長，有癢和刺痛感。②增生性瘢痕是嚴(yán)重?zé)齻つw愈合期，皮膚局部增生隆起，質(zhì)地較韌，形態(tài)不規(guī)則，伴疼痛感。③樣品均常規(guī)蘇木精-伊紅染色切片，并由兩位病理主治醫(yī)師閱片確診。

1.3方法

1.3.1 RT-PCR 試劑準(zhǔn)備：①基因組DNA 提取試劑盒（Promega 公司）；②PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；③質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；④脫氧核糖核酸、Pfu 酶（上海生工生物工程有限公司）。將500 μL Trizol試劑（Invtrogene公司）和100 μL氯仿加入100 mg組織樣品，混勻后離心，速度為14000 r/min，時間為10 min，離心后取上層水相，移至新EP 管后加入同等體積沉淀RNA，去上清液，精置干燥后加入10 μL去離子水溶解RNA，最后使用DEPC 處理，-80℃保存。Real-Time PCR操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，GAPDH作為內(nèi)參，95℃預(yù)變性15 min；95℃變性40 s，62℃退火，72℃延伸60 s，共進(jìn)行35 個循環(huán)，PCR產(chǎn)物長度為800 bp。擴(kuò)增Ct值的分析采用lightcycler 熒光定量PCR儀配備軟件。采用正常皮膚組的ΔCt值校正，根據(jù)2-ΔΔCT 數(shù)值計算得出檢測指標(biāo)。RT-PCR的引物設(shè)計根據(jù)國例Smad、TGF-β1基因片段的保守性區(qū)域以及GenBank 中Smad 基因堿基序列進(jìn)行，Smad、TGF-β1基因為 5'-CGCTTGATCCAAAGTGGAAT-3'，5'-GGTTGATGGCATTGGAAAGA-3'；TGF-β1為5"-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3，5-TCAAAAGA-CAGCCACTCAGG-3；GAPDH為5'-ACTTAGTTG-CGTTACACCCTTTCT-3'，5'-TTCATACATCTCAAGT-TGGGGGAC-3'。

1.3.2 流式細(xì)胞儀半定量檢測 半定量檢測Smad3和TGF-β1的表達(dá)產(chǎn)物：使用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定適量凍存的組織標(biāo)本，將標(biāo)本放于120目不銹鋼網(wǎng)上面，其下放置一個平皿，將組織剪碎，使用眼科鑷輕柔地搓組織標(biāo)本塊，同時使用0.9%NaCl溶液沖洗，直到搓完組織。使用300目銅網(wǎng)過濾平皿中的混懸液，將細(xì)胞團(tuán)塊去除，將細(xì)胞懸液倒入離心管，進(jìn)行離心，速度為800 r/min，時間為2 min，離心結(jié)束后去除上清液。向離心管內(nèi)加入 1mLPBS溶液重懸細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)，稀釋細(xì)胞液，直到濃度為1×109/L。取稀釋后的細(xì)胞懸液0.1 mL，加入0.1 mL Smad3或TGF-β1工作液，常溫孵育30 min。孵育結(jié)束后加入10 mLPBS溶液洗滌，去除上清液，加入100 μL FITC-IgG二抗工作液，避光常溫孵育30 min，加入10 mL PBS溶液，離心條件同上，去除上清液。加入0.1 mL PBS溶液，使用500目銅網(wǎng)過濾溶液，最后使用流式細(xì)胞儀檢測，操作步驟按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行，操作結(jié)束后應(yīng)用 Expo 32 ADC數(shù)據(jù)分析。

1.4 觀察指標(biāo)[2]

觀察三組患者組織標(biāo)本的Smad3及TGF-β1的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的大小。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者Smad3和TGF-β1的RT-PCR結(jié)果

瘢痕疙瘩組Smad3、TGF-β1的基因表達(dá)水平均高于正常皮膚組，增生性瘢痕組的Smad3、TGF-β1的基因表達(dá)水平同樣高于正常皮膚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 三組患者Smad3和TGF-β1的RT-PCR結(jié)果（x±s，μmol/L）

注：瘢痕疙瘩組與正常皮膚組相比，1）P<0.05；增生性瘢痕組與正常皮膚組相比，2）P<0.05

2.2三組患者的Smad3和TGF-β1 流式細(xì)胞儀結(jié)果

瘢痕疙瘩組的Smad3、TGF-β1的含量均高于正常皮膚組，增生性瘢痕組的Smad3、TGF-β1的含量同樣高于正常皮膚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 三組患者的Smad3和TGF-β1的流式細(xì)胞儀結(jié)果（x±s）

注：瘢痕疙瘩組與正常皮膚組相比，1）P<0.05；增生性瘢痕組與正常皮膚組相比，2）P<0.05

3 討論

瘢痕是由各種創(chuàng)傷發(fā)生后，處于愈合狀態(tài)的皮膚組織的外觀形態(tài)和組織病理學(xué)改變的統(tǒng)稱[3]。創(chuàng)傷的愈合長久以來都是醫(yī)學(xué)最為關(guān)注的問題之一，創(chuàng)傷的愈合由三個階段組成，即炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期、瘢痕形成/組織重塑期[4]。因此，瘢痕是正常組織損傷修復(fù)的過程，一般來說是無法避免的，大部分瘢痕形成的結(jié)果是出現(xiàn)生理性瘢痕，是指細(xì)小、平整、顏色接近周圍皮膚的瘢痕，如果形成的瘢痕大、凹凸不平、突出皮膚表面、顏色明顯不同于周圍皮膚則稱為病理性瘢痕。病理性瘢痕的發(fā)生率為4%～6%，臨床上，根據(jù)病理性瘢痕的不同，又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。增生性瘢痕表現(xiàn)為外形排列不規(guī)則，突出局部皮膚表面，瘢痕顏色潮紅，質(zhì)地實韌，或呈波浪形，或成繩索狀，有燒灼痛、癢感，大多發(fā)生在深度燒傷的創(chuàng)面愈合后。而瘢痕疙瘩表現(xiàn)為瘢痕過度生長，明顯超出原局部創(chuàng)傷范圍，呈蟹足狀增生并且侵犯周圍組織，不進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)不會消失，單純手術(shù)切除極易復(fù)發(fā)[5]。瘢痕疙瘩幾乎可以發(fā)生在所有的人種中，但是不同人種的發(fā)病率還是有所差異，其中黑種人發(fā)病率是白種人的15倍，而黃種人的發(fā)病率也比白種人高[6]。雖然瘢痕的形成是創(chuàng)傷修復(fù)的正常過程，是一種自我保護(hù)的表現(xiàn)，但是過度增生而形成的病理性瘢痕對患者帶來巨大的痛苦，尤其是皮膚發(fā)生病理性瘢痕，往往無法達(dá)到完美的治療修復(fù)，外觀的改變使患者自覺難以融入社會交往，同時，病理性瘢痕更是一種癌前病變，癌變率高達(dá)1%～2%，癌變潛伏期可為3 個月至數(shù)年或數(shù)十年，因此病理性瘢痕對于患者的身心影響是巨大的 [7，8]。

從臨床上觀察，病理性瘢痕的好發(fā)部位主要有前胸、后背部、耳部、肩三角部及下腹部等，傳統(tǒng)的手術(shù)切除曾是治療病理性瘢痕的主要方法，但是有文獻(xiàn)報道，單一手術(shù)直接切除病灶雖然短期內(nèi)的療效良好，但復(fù)發(fā)率高達(dá)45%～100%，因此，現(xiàn)在已經(jīng)很少采用單一手術(shù)切除作為治療病理性瘢痕的手段[9]。除了外科手術(shù)外，近年來，新的治療手段不斷出現(xiàn)，如糖皮質(zhì)激素注射療法、放射療法、激光療法、加壓療法、硅酮療法、基因治療等[10，11]。糖皮質(zhì)激素是治療病理性瘢痕的常見藥物，無論單獨(dú)使用抑或是術(shù)后瘢痕內(nèi)注射，都有確切療效；放射療法主要作用是放射線能夠顯著抑制成纖維細(xì)胞分裂、增殖及膠原纖維的合成，與糖皮質(zhì)激素類似，其既可單一使用，也可在瘢痕手術(shù)后輔助治療；激光治療目前也體現(xiàn)出巨大的治療潛力，但是其主要的局限性在于穿透性尚不足，瘢痕的深在部位不能很好的治療；加壓治療是較為簡單易行的方法，主要適應(yīng)證是瘢痕面積大和不適宜進(jìn)行其他方法治療的患者；硅凝膠膜是最近幾年發(fā)展起來的方法，它對人體皮膚無毒性，無刺激性，不會引起過敏反應(yīng)，具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景；轉(zhuǎn)基因治療尚處于研究階段，效果有待進(jìn)一步研究[12]。臨床上發(fā)現(xiàn)，單一的治療方法效果往往有其局限性，因此，目前對病理性瘢痕的治療主張多種方法合用。

病理性瘢痕的病理生理過程主要是因成纖維細(xì)胞增殖過度，同時膠原纖維也出現(xiàn)大量沉積導(dǎo)致皮膚真皮層出現(xiàn)纖維化，而成纖維細(xì)胞的生長失控又是病理性瘢痕形成過程中最重要的因素[13，14]。纖維化疾病的分子機(jī)制近年來也取得了較大進(jìn)展，目前已確定轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、白細(xì)胞介素、早期生長應(yīng)答蛋白1（EGR-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等的調(diào)控與纖維化疾病的發(fā)生有關(guān)[15]。而其中的TGF-β/Smad信號通路被認(rèn)為在纖維化中起重要的作用，在體外實驗中，Smad3-siRNA可特異性抑制成纖維細(xì)胞中Smad3基因表達(dá)，同時有效抑制了膠原纖維的合成[16，17]。Smad家族是在真核細(xì)胞中高度保守的分子，從線蟲、果蠅到哺乳動物均廣泛存在，研究表明Smad信號通路的過度活化誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的過度增殖[18]。目前證實細(xì)胞內(nèi)至少存在Smad 1～Smad 9這9種分子，而TGF-β作為配體形成的復(fù)合物在與胞膜受體特異性結(jié)合后，由Smad 蛋白家族介導(dǎo)，對細(xì)胞核內(nèi)特異的基因進(jìn)行調(diào)控，TGF-β1是TGF-β家族中的一種，具有強(qiáng)效趨化成纖維細(xì)胞的作用[19，20]。

本次研究結(jié)果表明，無論是Smad基因還是其表達(dá)情況，瘢痕疙瘩組的Smad3、TGF-β1均高于正常皮膚組，增生性瘢痕組的Smad3、TGF-β1同樣高于正常皮膚組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與龐久玲等[1]在Smad3和轉(zhuǎn)化生長因子β1在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮膚中的表達(dá)：48∶40∶40例標(biāo)本病理檢測研究中的部分結(jié)果一致，提示Smad3與TGF-β1介導(dǎo)了病理性瘢痕的發(fā)病過程，考慮與TGF-β/Smad 信號通路有關(guān)。有研究表明，TGF-β 能夠刺激瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KF）中多數(shù)膠原基因mRNA 及其蛋白產(chǎn)物的增加，故實驗結(jié)果也與體外實驗相切合[21]。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕雖然臨床表現(xiàn)不同，但是作為病理性瘢痕的亞型，發(fā)病過程都與TGF-β/Smad信號通路相關(guān)，但本次研究的結(jié)果并不能說明瘢痕疙瘩和增生性瘢痕出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)的原因，對此，有必要進(jìn)一步設(shè)計實驗進(jìn)行探索。

雖然病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制目前有多種學(xué)說和理論，但是其中可以確定的是 TGF-β/Smad 信號通路在病理性瘢痕中發(fā)揮重要作用[22]?？傊?，TGF-β1和Smad的表達(dá)是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的重要特征，如果能夠阻斷該信號通路的信息傳遞，或能夠抑制病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展。

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（收稿日期：2014-12-15）