鼠源性HSP70、GM—CSF雙修飾前列腺癌全細(xì)胞疫苗的建立與鑒定

馬琪 陳俊豐 蔣軍輝 王平 蔣照輝 程躍

[摘要] 目的 建立鼠源性HSP70、GM-CSF雙修飾前列腺癌全細(xì)胞疫苗。 方法 通過(guò)化學(xué)合成和PCR方法分別構(gòu)建小鼠Hspa1a、Csf2基因片段，TA克隆入pMD-18T載體測(cè)序驗(yàn)證。上述合成好的目的序列通過(guò)限制性內(nèi)切酶BamHI/AscI酶切、T4DNA連接酶連接，分別裝入慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3_MCS中，構(gòu)建慢病毒重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5。載有重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5的慢病毒液分別對(duì)鼠前列腺癌細(xì)胞系RM-1進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，10 Gy放射線照射使其喪失增殖能力后凍存。 結(jié)果 測(cè)序驗(yàn)證重組慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5構(gòu)建成功。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后分別或共轉(zhuǎn)染RM-1，Western blot證實(shí)GM-CSF、sHSP70表達(dá)，GM-CSF和HSP70共表達(dá)。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功建立了鼠HSP70、GM-CSF雙修飾RM-1細(xì)胞全細(xì)胞疫苗，為以后進(jìn)一步探討全細(xì)胞抗原作用機(jī)制和全細(xì)胞免疫增強(qiáng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 熱休克蛋白；巨噬細(xì)胞集落刺激因子；前列腺癌全細(xì)胞疫苗

[中圖分類(lèi)號(hào)] R730.3；R735.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）19-0001-04

去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer， CRPC）是當(dāng)前前列腺癌診治中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，利用免疫技術(shù)治療CRPC發(fā)展迅速，基于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗、全細(xì)胞腫瘤疫苗、細(xì)胞因子、抗體等多種方法在CRPC得到應(yīng)用。其中樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗APC 8015已于2010年通過(guò)FDA審批，并進(jìn)入NCCN指南，成為前列腺癌免疫治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展之一[1]。而與樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗同期進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的全細(xì)胞疫苗GVAX則未獲通過(guò)。 本研究擬在前列腺癌全細(xì)胞疫苗GVAX基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用熱休克蛋白70 （Hsp70）進(jìn)行修飾，利用全細(xì)胞疫苗和熱休克蛋白疫苗在理論上所具有的良好協(xié)同機(jī)制，發(fā)展新型全細(xì)胞前列腺癌治療性疫苗，為以后進(jìn)一步探討全細(xì)胞抗原作用機(jī)制和全細(xì)胞免疫增強(qiáng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

鼠前列腺癌細(xì)胞系RM-1細(xì)胞株購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，293T由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T 載體購(gòu)自Takara公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和AscI，T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金公司；platinum Pfx DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、慢病毒載體pLenti6.3-MCS、包裝質(zhì)粒混合物ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000、Opti-MEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶0.25% Trypsin-EDTA均購(gòu)自life technologies公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、標(biāo)簽抗體兔抗鼠Myc均購(gòu)自cell signaling 公司；標(biāo)簽抗體兔抗鼠V5購(gòu)自Abcam 公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；BCA蛋白測(cè)量試劑盒Thermo scientific公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 TA克隆 根據(jù)Genbank中 Hspa1a（NM-010479.2）和Csf2（NM-009969.4）的基因信息，對(duì)所需合成的目的序列進(jìn)行分析，檢查基因內(nèi)部有無(wú)特別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列連接。根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，分別進(jìn)行單鏈oligo的設(shè)計(jì)及化學(xué)合成。利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因序列（其中目的序列Hspa1a末端插入標(biāo)簽蛋白cMyc基因序列，Csf2末端插入標(biāo)簽蛋白V5基因序列）。將合成好的序列裝入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a。測(cè)序驗(yàn)證重組克隆中插入序列是否與要求相一致。本部分內(nèi)容由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 亞克隆 BamHI/AscI雙酶切TA克隆的目的片段，37℃酶切2 h，酶切體系為：10×buffer 5 μL，目的片段10 μL（約1 μg），BamHI 1μL，AscI 1 μL，ddH2O 23 μL。用BamHI/AscI把pLenti6.3_MCS進(jìn)行酶切，37℃酶切2 h，酶切體系為：10×buffer 5 μL，pLenti6.3_MCS 2 μL（約1 μg），BamHI 1 μL，AscI 1 μL，ddH2O 41 μL。電泳，回收酶切的目的片段。T4 DNA連接酶連接回收的片段與載體，室溫連接2 h，連接體系如下：連接緩沖液1 μL，慢病毒載體1 μL，目的片段2 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。從轉(zhuǎn)化的平板上挑去多個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 慢病毒的包裝與病毒滴度測(cè)定 取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每個(gè)10 cm的培養(yǎng)皿6×106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第2天轉(zhuǎn)染前移去培養(yǎng)液，添加5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液，取9 μg ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix和3 μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒加入1.5 mL Opti-MEM（經(jīng)37℃預(yù)熱）中輕輕混勻，取36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中輕輕混勻，室溫放置5 min；輕輕混合質(zhì)粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min。將3 mL質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物小心地加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后，更換完全培養(yǎng)液DMEM+10%FBS。48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000 rpm 離心10 min，去除細(xì)胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過(guò)濾。將病毒原液在50000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，置于-80℃ 保存?zhèn)溆?，并留少量慢病毒測(cè)定物理滴度。利用逐孔稀釋滴度測(cè)定法和熒光定量PCR法測(cè)定病毒滴度。標(biāo)準(zhǔn)品原液和病毒原液各10 μL分別進(jìn)行1∶10梯度稀釋?zhuān)缛?0 μL的慢病毒原液用無(wú)菌水稀釋100 μL，作為L(zhǎng)v-1，取10 μL Lv-1，用無(wú)菌水稀釋至100 μL，設(shè)為L(zhǎng)v-2，取10 μL Lv-2，用無(wú)菌水稀釋至100 μL，設(shè)為L(zhǎng)v-3，共計(jì)6個(gè)濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品和各稀釋度的慢病毒樣品，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算各稀釋液中的病毒滴度，如果三個(gè)稀釋度的CT值均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，可取其平均值。

1.2.4 慢病毒感染RM-1細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RM-1細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時(shí)，加入慢病毒感染液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分成5組，分別為CON組（空白對(duì)照組）、NC組（空病毒載體感染組）、pLenti6.3_ MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_Hspa1a_ cMyc/pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體共感染組。預(yù)實(shí)驗(yàn)明確pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組感染細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI）值為8，pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體感染組最佳MOI值為10。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)最佳MOI值，在RM-1細(xì)胞中加入適量病毒，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。

1.2.5 篩選穩(wěn)定表達(dá) HSP70、GM-CSF、HSP70/GM-CSF的RM-1細(xì)胞株并經(jīng)γ射線滅活后凍存慢病毒感染RM-1細(xì)胞48 h后，加入稻瘟菌素（Blasticidin，BSD） 4 μg/mL的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，10～14 d后可見(jiàn)陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)，挑去單細(xì)胞克隆，在24孔板中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，大約4周左右可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆細(xì)胞。收集病毒穩(wěn)定感染的RM-1細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣品取50 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后一抗4℃過(guò)夜。兔抗鼠cMyc和V5一抗孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，ECL發(fā)光，最后進(jìn)行膠片曝光、顯影定影。10 GYγ射線照射穩(wěn)定感染慢病毒的RM-1細(xì)胞后，-80℃保存待用。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

目的片段Hspa1a與CSf2 的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后分別與載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性菌落克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定測(cè)序后，用SECentral軟件與鼠Hspa1a（GenBank：NM-010479.2）、CSf2 cDNA（GenBank：NM_ 009969.4）序列比對(duì)，載體插入序列與Hspa1a、CSf2 cDNA序列一致（封三圖1A為Hspa1a部分測(cè)序序列，封三圖1B為CSf2部分測(cè)序序列），表明重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_CSf2_V5構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用利用逐孔稀釋滴度測(cè)定法和熒光定量PCR法測(cè)定病毒滴度。慢病毒pLenti6.3_MCS_ Hspa1a_cMyc濃縮后的病毒滴度測(cè)定計(jì)算結(jié)果為（5.04×108）TU/mL，慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5濃縮后的病毒滴度為（6×108）TU/mL。

2.3 慢病毒感染RM-1后Western blot檢測(cè)HSP70、GM-CSF蛋白的表達(dá)

慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc感染RM-1后提蛋白，以cMyc為抗原檢測(cè)融合蛋白Hspa1a_cMyc的表達(dá)，結(jié)果觀察到70～100 kDa之間有一條特異性條帶，其大小和Hspa1a_cMyc融合蛋白相符合（HSP70蛋白分量為70 kDa，cMyc標(biāo)簽對(duì)目的蛋白分子量影響較小）（圖2A，第4泳道）；慢病毒pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5感染RM-1，以V5為抗原檢測(cè)融合蛋白CSf2_ V5的表達(dá)，結(jié)果觀察到25 kDa左右有一條特異性條帶，其大小和CSf2_V5融合蛋白相符合（鼠CSf2蛋白分子量為22 kDa）（圖2B，第3泳道）。慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc與pLenti6.3_MCS_CSf2-V5共感染RM-1，以cMyc為抗原檢測(cè)時(shí)，結(jié)果觀察到70～100 kDa之間有一條特異性條帶，以V5為抗原檢測(cè)時(shí)結(jié)果觀察到25 kDa左右有一條特異性條帶（圖2A，第5泳道；圖2B，第5泳道）。這些結(jié)果說(shuō)明包裝產(chǎn)生的高滴度慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc、pLenti6.3_MCS_CSf2_V5感染細(xì)胞后能穩(wěn)定表達(dá)Hsp70和GM-CSF蛋白。

A：以cMyc為抗原檢測(cè)融合蛋白Hspa1a_cMyc的表達(dá)；B：以cMyc為抗原檢測(cè)融合蛋白Csf2_V5的表達(dá)。

1：空白對(duì)照；2：空載體對(duì)照；3：轉(zhuǎn)染慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5組；4：轉(zhuǎn)染慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc組；5：共轉(zhuǎn)染pLenti6.3_ MCS_CSf2_V5/pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc組

圖2 Western blot 檢測(cè)病毒穩(wěn)定感染RM-1后細(xì)胞中融合蛋白Hspa1a_cMyc、CSf2_V5、Hspa1a_cMyc/CSf2_V5的表達(dá)

3 討論

目前免疫治療已經(jīng)成為前列腺癌治療中的熱點(diǎn)。多種疫苗、細(xì)胞因子和抗體已應(yīng)用于前列腺癌的治療，并表現(xiàn)出了一定效果。目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)和正在進(jìn)一步發(fā)展的前列腺癌免疫治療的方法和專(zhuān)利包括樹(shù)突狀疫苗（如APC8015[2]，DCVax-Prostate[3]）、全細(xì)胞疫苗（如GVAX[4]）、DNA疫苗（Prostvac-VF[5]）、單克隆抗體（如MDX-010[6]，MK-3475[7]，J591[8]）等。

在諸多的免疫治療手段中，研究較多的是APC8015和GVAX。APC8015（sipuleucel-T，Provenge）是一種治療CRPC的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，由于樹(shù)突狀細(xì)胞是一種最有效的抗原遞呈細(xì)胞，使樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗成為前列腺癌免疫治療中的首選方式之一。研究者們?cè)?010年6月報(bào)道了一項(xiàng)多中心的，隨機(jī)、對(duì)照、雙盲的臨床研究結(jié)果，在這項(xiàng)重要的研究里，與對(duì)照組比較，APC8015（又稱sipuleucel-T）降低了22%的激素抵抗性前列腺癌的死亡危險(xiǎn)，36個(gè)月的生存概率sipuleucel-T較對(duì)照組高8.7%[2]。由于這個(gè)重要的結(jié)果，F(xiàn)DA批準(zhǔn)sipuleucel-T在臨床上的使用[9]，sipuleucel-T是首個(gè)供臨床應(yīng)用的前列腺癌治療性疫苗，也是近年來(lái)前列腺癌診治研究上最重要的進(jìn)展[10-11]。

與sipuleucel-T同一階段進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的還有全腫瘤細(xì)胞疫苗GVAX。GVAX即使用前列腺癌細(xì)胞系Lncap和PC3，經(jīng)過(guò)基因修飾后，使其表達(dá)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF）。GM-CSF是一種最強(qiáng)的樹(shù)突狀細(xì)胞活化因子，因而有利于樹(shù)突狀細(xì)胞在體內(nèi)的局部聚集和活化，增強(qiáng)對(duì)前列腺癌抗原的識(shí)別和遞呈。在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，GVAX能夠降低血PSA水平，延緩PSA再上升時(shí)間[12]。然而GVAX在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中卻令人失望。至2009年，相繼兩項(xiàng)大規(guī)模關(guān)于GVAX的Ⅲ期臨床試驗(yàn)因效果不佳而被迫提前終止[13-14]。

與基于自體樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤疫苗比較，基于腫瘤細(xì)胞株的全細(xì)胞疫苗有一定優(yōu)點(diǎn)。一方面，全細(xì)胞疫苗理論上含有腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigens，TAAs），另一方面，無(wú)需針對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行單獨(dú)的個(gè)體疫苗制備，因而更適合規(guī)模制備和質(zhì)量控制。然而，全細(xì)胞疫苗同樣存在明顯的缺點(diǎn)，那就是免疫原性不高，雖然經(jīng)過(guò)基因改造增加局部GM-CSF表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞聚集、增殖和抗原遞呈功能，與樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗比較，全細(xì)胞疫苗上仍然存在免疫原性差的問(wèn)題。

在免疫識(shí)別過(guò)程中，HSP對(duì)抗原遞呈特別重要。特別是Hsp70，它能夠結(jié)合TAAs，將TTAs傳遞到APC表面與主要組織相容復(fù)合物（major histocompatibility complex， MHC-1）類(lèi)分子結(jié)合，此后APC細(xì)胞通過(guò)相互遞呈機(jī)制，將腫瘤抗原識(shí)別信號(hào)遞呈給T細(xì)胞，激活細(xì)胞免疫。由于HSP70能夠結(jié)合多種TAAs，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞等APCs的識(shí)別和吞噬，并且提供免疫激活的關(guān)鍵信號(hào)[15]，以HSP70為基礎(chǔ)的治療性疫苗表現(xiàn)出一定提升腫瘤免疫的效果[16-17]。我們認(rèn)為，HSP70的這個(gè)特性特別適合用于全細(xì)胞抗原的免疫增強(qiáng)。此外，樹(shù)突狀細(xì)胞含有熱休克蛋白受體，易于被樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別捕獲，并進(jìn)行處理和抗原遞呈，我們認(rèn)為，HSP70的這個(gè)特性與GM-CSF的激活DCs的特性恰恰互補(bǔ)，一個(gè)激活抗原遞呈細(xì)胞，一個(gè)強(qiáng)化抗原遞呈過(guò)程?；贖SP70與GM-CSF在抗原識(shí)別與遞呈方面良好的協(xié)同作用機(jī)制，HSP70，GM-CSF雙修飾的激素非依賴性前列腺癌全細(xì)胞疫苗可能具有良好的治療效果。

慢病毒載體是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，具有轉(zhuǎn)移效率高、其介導(dǎo)的基因表達(dá)持續(xù)穩(wěn)定、隨宿主細(xì)胞基因組分裂而分裂及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已越來(lái)越受研究人員的青睞。本研究使用慢病毒載體載入鼠源性GM-CSF分子、sHSP70分子感染293T細(xì)胞后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5；通過(guò)病毒包裝、收集和濃縮，得到了高滴度慢病毒顆粒；用于穩(wěn)定感染細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)到GM-CSF和HSP70的蛋白表達(dá)，成功獲得了鼠源性HSP70、GM-CSF雙修飾鼠前列腺癌全細(xì)胞疫苗。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立了鼠RM-1細(xì)胞系全細(xì)胞疫苗，為日后發(fā)展進(jìn)一步研究全細(xì)胞抗原作用機(jī)制，并為發(fā)展新型人源性前列腺癌疫苗建立基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-02-10）