非洲豬瘟病毒感染的流行病學(xué)及其疫苗的研究進(jìn)展

魏 其，屈勇剛*，楊慧敏，任 敏，谷思穎，吳圓圓，于會(huì)舉

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

近年來(lái)隨著我國(guó)與世界貿(mào)易活動(dòng)的增加，引入外來(lái)動(dòng)物疫病的風(fēng)險(xiǎn)增大，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。ASF是一種外來(lái)動(dòng)物疫病，于2018年8月在中國(guó)首次出現(xiàn)。ASF是由ASFV引起的一種急性、出血性、烈性傳染病，患病豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、黏膜廣泛出血等臨床癥狀，具有發(fā)病病程短、病死率高等特征，已對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重危害。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)已將該病列為法定通報(bào)的動(dòng)物疫病，也是我國(guó)重點(diǎn)防范的疫病類型之一[1]。我國(guó)作為一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，目前還尚未研制出有效的疫苗去解決ASF對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的影響。

為了強(qiáng)有效地做好疫病的防范工作，更快地研制出有效疫苗，增強(qiáng)國(guó)民及其相關(guān)工作人員對(duì)疫病的防范意識(shí)，文章將從非洲豬瘟的病原學(xué)、流行病學(xué)以及疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為更有效地防控非洲豬瘟病毒提供理論依據(jù)。

1 病原學(xué)

1.1 ASFV的形態(tài)結(jié)構(gòu)

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，與虹彩病毒科和痘病毒科的某些特征具有相似性。ASFV是一種單分子線狀雙鏈DNA病毒，由囊膜包裹，二十面體對(duì)稱，直徑僅有175～215 nm，在該病毒粒子的衣殼中心有一個(gè)孔，使其結(jié)構(gòu)呈特殊的六棱鏡狀[2]。ASFV基因組全 長(zhǎng) 170～ 190 kb， 具 有 151個(gè)開放閱讀框ORFs，共編碼大約150～200種蛋白，該病毒成熟的粒子中含有50種以上的主要蛋白，在感染過(guò)程中起著重要作用[3]。其中，P72占病毒粒子總蛋白量的1/3，蛋白序列保守，具有良好的抗原性，感染后可產(chǎn)生高滴度的抗P72抗體，通常用于非洲豬瘟的血清學(xué)診斷。根據(jù)P72基因C端的核酸序列，可將非洲豬瘟分為24種基因型[4]。非洲豬瘟病毒的基因組容易發(fā)生變異，遺傳過(guò)程多種多樣，難以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，因此對(duì)血清型尚未分類。

通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切圖譜分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于美洲和歐洲的ASFV是同一種基因型，而分離到的非洲毒株卻具有多種基因型，這表明來(lái)自不同區(qū)域的毒株之間存在較大的基因型差異。第一個(gè)被確定基因組全序列的毒株，是一株無(wú)毒力的西班牙BA71V分離株，常作為實(shí)驗(yàn)室研究的對(duì)象。目前，已測(cè)定11株ASFV全基因序列。

1.2 ASFV的理化特性

非洲豬瘟病毒具有囊膜結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白酶具有抗性，對(duì)脂類溶劑和氧化劑敏感，如乙醚、氯仿、酒精、甲醛等消毒劑，對(duì)該病毒的消毒處理是有效的，可以通過(guò)胰酶、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、高溫條件滅活。然而，該病毒在pH 4～10的環(huán)境下非常穩(wěn)定，可在冷凍的血清和組織中存活數(shù)年，在糞便和尸體中存活數(shù)周至一年，在一些被污染的肉制食品中可長(zhǎng)期存活并造成感染，比如半熟肉、泔水、腌制或煙熏的火腿和香腸[5]。

非洲豬瘟病毒主要感染宿主的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，通過(guò)巨胞飲以及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用完成入侵[6]。該病毒可在雞胚卵黃囊和骨髓細(xì)胞中增殖，原代、傳代細(xì)胞可用于病毒的體外分離培養(yǎng)。

2 流行病學(xué)

2.1 ASFV臨床癥狀及病理變化

自然感染非洲豬瘟病毒的潛伏期一般在4～19 d?；疾∝i具有臨床癥狀，例如體溫升高、呼吸困難和黏膜廣泛性出血等。根據(jù)病毒的毒力、感染劑量和感染途徑的不同，臨床癥狀存在一定差異，表現(xiàn)為最急性、急性、亞急性、慢性或隱性感染。最急性型通常不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，并在2～3 d內(nèi)突然死亡。急性和亞急性的特征在于廣泛性出血和淋巴組織壞死。一些慢性或亞臨床病例具有非常輕微或幾乎沒(méi)有病變。感染非洲豬瘟并發(fā)病的豬內(nèi)臟器官出現(xiàn)廣泛性出血，心臟出血嚴(yán)重，整個(gè)心包被血液充盈，在心內(nèi)膜及漿膜也可見出血點(diǎn)[7]。一般一頭豬并不會(huì)表現(xiàn)出所有的病理變化，但從幾頭豬幾乎就可以看到所有的臨床癥狀，在臨床排查時(shí)要謹(jǐn)慎，不要將其與豬的其他繁殖障礙性疾病混淆。

2.2 流行現(xiàn)狀

第一例ASF 病例于1921年在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，并且在撒哈拉以南的非洲國(guó)家流行。1957年入侵至西歐和拉美國(guó)家，在葡萄牙的里斯本地區(qū)首次發(fā)生，隨后多個(gè)國(guó)家陸續(xù)發(fā)生，1971年南美洲的古巴首次報(bào)道，2007 年傳入東歐和俄羅斯，對(duì)我國(guó)造成了極大威脅[8]。2018年8月，我國(guó)第一起非洲豬瘟疫情在遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)發(fā)生，隨后在多個(gè)省市陸續(xù)發(fā)生流行，截至目前全國(guó)已有23個(gè)省市發(fā)生非洲豬瘟疫情，由此可見非洲豬瘟具有流行速度快、傳播范圍廣、外界生存能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.3 傳染源及傳播途徑

豬是非洲豬瘟病毒的唯一天然宿主，主要靠發(fā)病豬和帶毒豬進(jìn)行傳播，攜帶病原的組織、血液及各種分泌物、排泄物中均含有高滴度病毒，被病毒污染過(guò)的物質(zhì)都能成為傳染源。歐洲野豬對(duì)病毒敏感，但有3種非洲野豬（疣豬、大林豬、非洲野豬）感染后沒(méi)有明顯的臨床癥狀，隱性帶毒造成感染，是病毒的儲(chǔ)存器[9]。

非洲豬瘟可以通過(guò)多種方式傳播，如直接接觸攜帶病原的豬（直接傳播）；通過(guò)病毒污染物傳播（間接傳播）。軟蜱等吸血昆蟲都是 ASFV 的傳染源[10]，軟蜱叮咬后，病毒可長(zhǎng)期在軟蜱體內(nèi)存活，通過(guò)叮咬進(jìn)行傳播。

2.4 易感動(dòng)物及其保護(hù)

1921年，Montgomery設(shè)法感染白鼠、天竺鼠、兔、貓、犬、山羊、綿羊、牛、馬、鴿等動(dòng)物，都未成功。但Velho在1956年報(bào)告，通過(guò)兔子傳26代后攻毒豬照樣致死豬，這表明此病毒只對(duì)豬易感，對(duì)其他動(dòng)物不造成感染。

目前非洲豬瘟已傳入我國(guó)，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的威脅，國(guó)家應(yīng)加強(qiáng)生物安全的養(yǎng)殖建設(shè)措施，提供技術(shù)服務(wù)，嚴(yán)格檢查檢疫工作，發(fā)現(xiàn)病豬及疑似病豬必須及時(shí)上報(bào)，做到 早期發(fā)現(xiàn)、快速報(bào)告、快速診斷、嚴(yán)格處置”。目前我國(guó)非洲豬瘟疫病尚處于非常時(shí)期，嚴(yán)禁與疫情國(guó)家進(jìn)行貿(mào)易，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)管理制度，密切關(guān)注周邊地區(qū)及養(yǎng)豬場(chǎng)的疫情，將防控級(jí)別提高到最高水平?？紤]到我國(guó)對(duì)非洲豬瘟預(yù)防和控制的復(fù)雜性、艱巨性和長(zhǎng)期性，短期內(nèi)是非常難以消滅非洲豬瘟，要在打好攻堅(jiān)戰(zhàn)的同時(shí)，做好打持久戰(zhàn)的準(zhǔn)備[11]。

3 非洲豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

3.1 滅活疫苗的研究

滅活疫苗在首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒后就開始研制，但效果不佳。滅活疫苗因自身固有的缺陷，難以刺激先天免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫，雖部分能刺激豬產(chǎn)生抗體，但很難檢測(cè)到中和抗體的存在。隨著對(duì)ASF研究的深入，Blome等[12]研究結(jié)果表明，使用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen?-D等仍然無(wú)法抵御ASFV的攻擊。

3.2 亞單位疫苗

ASF亞單位疫苗使用桿狀病毒為表達(dá)載體，在原核或真核細(xì)胞中將具有中和表位的非洲豬瘟病毒的保護(hù)性抗原進(jìn)行表達(dá)，然后將得到的蛋白質(zhì)或多肽與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合以誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的抗ASFV 中和抗體。ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白種類很多，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)作用的有3種重要抗原蛋白P72、P54、P30[13]。產(chǎn)生P72和P54的抗體可以防止病毒吸附，P30的抗體可阻止病毒內(nèi)吞作用。在P30、P72和P54中表達(dá)的重組蛋白只能延緩臨床癥狀并降低病毒血癥水平，僅能提供50%的保護(hù)而不能達(dá)到有效保護(hù)[14]。ASFV具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫逃避機(jī)制，緊靠上述3者抗原刺激產(chǎn)生的中和抗體很難獲得良好的免疫保護(hù)效果[15]。

3.3 病毒活載體疫苗和減毒活疫苗

目前，關(guān)于病毒活載體疫苗主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答上。有相關(guān)研究以狂犬病病毒、痘病毒或腺病毒等作為載體表達(dá)ASFV保護(hù)性抗原基因，以期獲得更好的細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic lymphocyte CTL）反應(yīng)[16]。為獲得理想的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，使用 雞尾酒 式混合免疫，但這些研究未進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，需進(jìn)一步驗(yàn)證保護(hù)效果，確保該疫苗研制方法的可行性。

減毒活疫苗(Live attenuated vaccines，LAV)可根據(jù)毒株的來(lái)源將其分為三類：傳代致弱毒株、天然致弱毒株和重組致弱毒株。ASF在西班牙和葡萄牙流行期間，使用傳代致弱毒株免疫動(dòng)物后出現(xiàn)了肺炎、流產(chǎn)和死亡等副作用[17]。隨后Krug[18]等在Vero細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)分離株ASFV-G，傳至第110代時(shí)病毒毒力完全喪失，但接種到家豬體內(nèi)并未獲得有效保護(hù)。用天然致弱毒株免疫動(dòng)物后，可以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)ASFVⅠ型的不同分離毒株產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)，但同時(shí)有不可估量的副作用，存在諸多安全隱患問(wèn)題。

重組致弱毒株可以通過(guò)敲除病毒某種特殊基因（病毒毒力基因、免疫逃避相關(guān)基因等），降低病毒毒力而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，研制出既安全又有效的基因工程減毒活疫苗。研究表明，一些毒株缺失部分基因后，接種宿主后缺失毒株毒力降低，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)同源毒株或異源毒株的特異性免疫保護(hù)。宿主免疫系統(tǒng)受到編碼多種蛋白的ASFV干擾，目前已有的病毒免疫逃避相關(guān)基因有A238L、A179L、A224L、DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R，因 此，這些基因的缺失有助于增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)。為了鑒定合適的缺失靶基因及其組合，需要更深入地研究來(lái)研制產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答且沒(méi)有相應(yīng)副作用的ASFV減毒疫苗。

3.4 核酸疫苗

又稱DNA疫苗，研制技術(shù)并不是很成熟。Argilaguet[19]等將ASFV 的 P72、P30和 P54基因克隆到真核表達(dá)載體上，制備ASF的DNA疫苗，但DNA疫苗免疫豬后并不能提供針對(duì)感染的保護(hù)。在真核表達(dá)載體中融合表達(dá)ASFV P30和P54基因與豬白細(xì)胞抗原II的特異性抗體單鏈可變區(qū)基因，可以讓一些動(dòng)物獲得免疫保護(hù)。最新研究發(fā)現(xiàn)，ASFV基因組DNA質(zhì)粒表達(dá)文庫(kù)提供60%的保護(hù)力，并且需要用ASFV 抗原構(gòu)建的多種DNA疫苗以獲得更高的免疫保護(hù)作用。則在這一方面應(yīng)尋找更多，提高核酸疫苗的保護(hù)水平。

3.5 疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)

當(dāng)前面臨最大的挑戰(zhàn)是怎樣解決ASF疫苗。亞單位、DNA 疫苗雖可以誘導(dǎo) ASFV 產(chǎn)生特異性抗體及相應(yīng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但最大的問(wèn)題是不能提供完全保護(hù)。部分基因缺失疫苗雖可以提供安全保護(hù)，也無(wú)法排除免疫動(dòng)物后靠殘余的毒力引起動(dòng)物出現(xiàn)亞臨床癥狀和病毒血癥。

ASF疫苗在研發(fā)過(guò)程中，需進(jìn)一步研究病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，熟悉其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，了解病毒與宿主之間相互作用的機(jī)制，為研究ASF疫苗提供依據(jù)和方向。有關(guān)免疫逃避相關(guān)蛋白的研究甚少，深入研究相關(guān)機(jī)制將有助于 ASF 疫苗研發(fā)。

4 討論

ASF是一種重要?jiǎng)游镆卟?，具有?fù)雜的病原結(jié)構(gòu)和流行病學(xué)。目前，關(guān)于非洲豬瘟疫情對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅的問(wèn)題，已按照《非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)排查手冊(cè)》做好全面的消毒和防控工作，尚未得到有效解決，研發(fā)安全有效的ASF疫苗迫在眉睫。因此，就ASF問(wèn)題從病原學(xué)、流行病學(xué)及疫苗的研究進(jìn)行討論，以期為非洲豬瘟的防控措施提供依據(jù)，為研制有效疫苗提供參考。