ZnO納米顆粒水凝膠高分子材料的合成及梭曼體內(nèi)外染毒洗消性能的評(píng)價(jià)

王甲朋，孟凡榮，范麗雪，李萬(wàn)華，隋 昕，駱 媛，田 萌，全東琴，王永安，張有志，楊 軍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；2.中國(guó)人民解放軍第32104部隊(duì)，內(nèi)蒙古阿拉善 735400；3.原濟(jì)南軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250014；4.天津市河北區(qū)光復(fù)道街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300143）

神經(jīng)性毒劑是經(jīng)典化學(xué)戰(zhàn)劑中毒性最強(qiáng)的致死性、速殺性毒劑，可經(jīng)呼吸道和皮膚等多種途徑中毒，極短時(shí)間引發(fā)中毒甚至死亡，最有效的清除毒劑的方法是對(duì)其進(jìn)行快速高效的洗消［1］。近年來，金屬氧化物洗消因其獨(dú)特的廣譜、穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，引起了許多國(guó)家的關(guān)注。常見金屬氧化物有ZnO，TiO2，Al2O3和MgO等。金屬氧化物洗消原理是利用其表面有酸/堿性位點(diǎn)吸附神經(jīng)性毒劑［2］，其半導(dǎo)體性質(zhì)可使其價(jià)帶的電子遷移到導(dǎo)帶，留下強(qiáng)氧化性的空穴，可有效分解毒劑［3］。金屬氧化物主要通過自身的金屬離子的活性來催化分解毒劑［4］。其優(yōu)點(diǎn)是毒劑分解范圍廣譜；本身穩(wěn)定性高［5］，不易被破壞［6］，適用于多種較復(fù)雜環(huán)境下的洗消；其在分解毒劑過程中擔(dān)負(fù)催化劑的角色，自身不被破壞，可持續(xù)洗消；該材料無(wú)明顯刺激性和腐蝕性，可用于設(shè)備和人體的清洗；其納米顆粒有一定的吸附能力，可實(shí)現(xiàn)吸附毒劑而后進(jìn)行快速分解的洗消。但其仍存在一些缺陷，如溶解度極低，難以均勻分散在溶液中；難以快速大量全方位地進(jìn)行洗消；其納米顆粒的吸附能力仍然有限。上述這些缺點(diǎn)導(dǎo)致其在實(shí)際洗消過程中對(duì)毒劑洗消速率仍較慢、效率較低。ZnO作為化妝品的成分，本身對(duì)皮膚和設(shè)備無(wú)刺激無(wú)腐蝕，而對(duì)神經(jīng)性毒劑等有一定的洗消效果。本研究選取目前最為常見和報(bào)道的ZnO作為洗消材料進(jìn)行研究。

為了解決ZnO納米顆粒（ZnO nanoparticle，ZnO NP）洗消速率慢、洗消率低等問題，本實(shí)驗(yàn)采用一種穩(wěn)定無(wú)毒的納米凝膠［7］對(duì)其進(jìn)行修飾和改進(jìn)，合成出了ZnO NP水凝膠（ZnO NP-gel）高分子材料，評(píng)價(jià)了其物理學(xué)特性，重點(diǎn)考察其用于神經(jīng)性毒劑梭曼的洗消效率和洗消速率。

1 材料與方法

甲基丙烯酸-2（N，N-二甲基）乙酯購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和N，N，N′，N′-四甲基二乙胺購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar；過硫酸鉀K2S2O8購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；聯(lián)苯胺購(gòu)自美國(guó)Adamas Reagent；4-戊烯酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。氯化鋅（ZnCl2）、聚乙烯醇（polyving alcohol，PVA）、丙酮、甲苯和過硼酸鈉等均購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

3-18K型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；S-3400N掃描電子顯微鏡與H-7650型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Zeta Sizer Nano-ZS90型zeta粒徑分布儀（英國(guó)馬爾文公司）；UV-4802紫外分光光度計(jì)（上海尤尼科儀器有限公司）；550型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；三用水箱（北京長(zhǎng)風(fēng)公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.1 藥品、試劑和主要儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量22～23 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。

1.3 ZnO NP及ZnO NP-gel的制備

1.3.1 ZnO NP的制備

采用化學(xué)沉淀法制備ZnO NP。主要原理是將金屬可溶性鹽溶液分散于水中，加入強(qiáng)堿后生成不可溶的金屬氫氧化物，隨后自身水解成ZnO NP［8-10］。制備過程：將2 mL ZnCl2（n水∶nZnCl2=1388.9∶1，n為摩爾數(shù)）滴入500 mL PVA（V水∶VPVA=100∶1）的體系中攪拌分散，隨后滴加NaOH（n水∶nNaOH=926∶1）水溶液，攪拌2 h后，離心收集ZnO NP初產(chǎn)品，于電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥過夜后，在馬弗爐中500°C高溫煅燒8 h，收集ZnO NP，得產(chǎn)品1.6 g。

1.3.2 ZnO NP-戊烯酸的制備

ZnO NP表面進(jìn)行基團(tuán)活化［11-12］，目的是在顆粒表面引入活性基團(tuán)，以便參與下一步水凝高分子聚合反應(yīng)。稱取ZnO NP 1.6 g加入到120 mL甲苯中，超聲0.5 h后攪拌分散ZnO NP。隨后加入4-戊烯酸2.4 mL，于50°C水浴環(huán)境中避光800×g攪拌4 h。離心除掉未反應(yīng)的4-戊烯酸，收集沉淀，得到ZnO-戊烯酸前體化合物。

1.3.3 ZnO NP-gel的制備

將含烯鍵的ZnO-戊烯酸前體化合物加入到95%乙醇200 mL中，超聲10 min并充分?jǐn)嚢璺稚悠贰ｋS后依次加入1.6 mL甲基丙烯酸-2（-N，N-二甲氨基）乙酯、1.12 g N，N′亞甲基雙丙烯酰胺，290 μL N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，1.12 g過硫酸鉀，于70 °C水浴避光反應(yīng)10 h。產(chǎn)物過濾收集，得灰白色沉淀1.7833 g。

1.4 ZnO NP-gel的物理學(xué)性質(zhì)檢測(cè)

取微量ZnO NP及ZnO NP-gel混懸液將其滴于清潔硅片上，待水干后將硅片置于樣品臺(tái)上，用掃描電子顯微鏡觀測(cè)其形態(tài)；隨后再將該懸濁液滴于銅網(wǎng)上，待水干后將銅網(wǎng)放置于樣品竿上，用透射電子顯微鏡觀測(cè)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；吸取部分懸濁液采用0.22 μm膜過濾后，用粒度分布儀測(cè)試其zeta電位；吸取適量樣本滴于2 cm×2 cm載玻片上，重復(fù)滴加多次，待干燥后，將樣品置于X射線衍射儀器下觀察；最后取其少量干粉（5～10 mg）進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，得到紅外光譜結(jié)果。

1.5 包封率和載藥率測(cè)定

記錄ZnO NP投入量為M1，稱量最終產(chǎn)物量為M2，取200 mg ZnO NP-gel在500°C下煅燒，去除合成的水凝膠等有機(jī)組分，得到殘余ZnO NP的量為M3，計(jì)算包封率和載藥率。載藥率（%）=M3/200×100%；包封率（%）=M2×（M3/200）/M1×100%

1.6 ZnO NP-gel體外對(duì)梭曼的洗消效果評(píng)價(jià)

1.6.1 梭曼的聯(lián)苯胺反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)

配制洗消反應(yīng)的溶液試劑：飽和聯(lián)苯胺水溶液；0.25%過硼酸鈉水溶液；丙酮-PBS 0.01 mol·L-1溶液（200 mL丙酮和90 mL PBS水溶液混勻）；取90%純度的梭曼稀釋1000倍，標(biāo)定為母液（濃度為1.0443 g ·L-1），于冰塊中儲(chǔ)存。

通過聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)［13］測(cè)得梭曼的聯(lián)苯胺反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.4184x+0.0525，R2=0.9992（式1），式中y為吸光度值，x為梭曼濃度（g ·L-1）。梭曼濃度在0～0.1 g ·L-1范圍內(nèi)，其吸光度值在該線性范圍內(nèi)。通過該線性關(guān)系可以測(cè)定殘余梭曼的含量。

1.6.2 檢測(cè)不同濃度ZnO NP和ZnO NP-gel對(duì)梭曼洗消效率

取90%純度的梭曼稀釋至52.2 mg ·L-1。取ZnO NP及ZnO NP-gel分別配成0，0.1，0.5，2和10 g·L-1，取150 μL加入到1.5 mL EP管，每組重復(fù)3次，各組均加入梭曼50 μL，隨后放入三用水箱中水?。?7°C，20 min）。隨后依次加入600 μL丙酮-PBS溶液，飽和聯(lián)苯胺溶液300 μL，0.25%過硼酸鈉溶液300 μL，混勻，而后放入37°C隔水式恒溫培養(yǎng)箱（靜置5 min），而后離心吸取上清，加入96孔板，每孔200 μL，放入酶標(biāo)儀中，測(cè)定在414 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

根據(jù)式（1）可得出對(duì)梭曼的洗消效率的計(jì)算公式：x=（y-0.05232）/1.418×50（式2），式中x為梭曼濃度，y為吸光度值。

洗消率（%）=（x0-x1）/x0×100%，x1為不同濃度洗消劑的梭曼濃度，x0為不加洗消劑的梭曼濃度。

1.6.3 測(cè)定不同時(shí)間ZnO NP及ZnO NP-gel對(duì)梭曼洗消速率

取90%純度的梭曼稀釋至52.2 mg ·L-1。配ZnO NP及ZnO NP-gel 2 g ·L-1，分別取3.75 mL加入到10 mL EP管中，而后加入梭曼1.25 mL，充分混勻，放入三用水箱中水?。?7°C）。每隔一定時(shí)間點(diǎn)從該EP管中取200 μL，隨后的聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)操作步驟同1.6.2。

1.7 梭曼ZnO NP-gel洗消液染毒小鼠毒性評(píng)價(jià)

選取24只體質(zhì)量為22～23 g的雄性昆明小鼠，分為ZnO NP-gel洗消組、ZnO NP洗消組、梭曼對(duì)照組和正常對(duì)照組，每組6只受試動(dòng)物。配10 mL梭曼52.2 mg ·L-1，ZnO NP-gel 1 g·L-1，ZnO NP 1 g ·L-1。ZnO NP-gel洗消組、ZnO NP洗消組和梭曼對(duì)照組（無(wú)菌注射用水）分別按3∶1（V∶V）體積比加入洗消劑（正常對(duì)照組為無(wú)菌注射用水）和梭曼，正常對(duì)照組按3∶1（V∶V）體積比加入無(wú)菌注射用水；4組均于37°C水浴中靜置30 min，而后攪拌30 s，隨后分別用0.22 μm的過濾器過濾去除沉淀，收集濾出液。sc給予小鼠濾出液40 μL·g-1，觀察驚厥和死亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料采用±s形式表示，采用Graphpad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間資料兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZnO NP-gel物理表征

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ZnO NP為一維棒狀結(jié)構(gòu)，尺寸約為300 nm×100 nm（圖1A和B）；ZnO NP-gel為塊狀結(jié)構(gòu)，尺寸約為400 nm×250 nm，大量粘連成塊（圖1C和D）。

透射電鏡（圖2）下，ZnO NP為不規(guī)則的棒狀實(shí)心結(jié)構(gòu)（圖2A和B）；ZnO NP-gel則為塊狀結(jié)構(gòu)，通過內(nèi)外襯度的差異可看出，外層包裹上了一層高分子層（圖2C和D）。

ZnO NP-gel zeta電位為（-7.89±0.04）mv，ZnO NP為（-0.0628±0.0095）mV。水凝膠修飾后其zeta電位絕對(duì)值增加，說明分散性更好。

Fig.1Images of zinc oxide nanoparticles（ZnO NP）（A，B）and zinc oxide nanoparticles hydrogels（ZnO NP-gel）（C，D）by scanning electron microscope.

Fig.2 Images of ZnO NP（A，B）and ZnO NP-gel by transmission electron microscope.

圖3為ZnO NP和ZnO NP-gel的x射線衍射數(shù)據(jù)處理的結(jié)果。合成的ZnO NP-gel高分子材料，在2θ=8.06738°可見明顯尖峰（紅色），為修飾后高分子的晶體衍射峰，而ZnO NP僅出現(xiàn)ZnO的晶體特征衍射峰（綠色）。通過兩衍射峰對(duì)比可知，水凝膠成功修飾到ZnO NP上。

Fig.3 Data processing results of X-ray diffraction of ZnO NP（green）and ZnO NP-gel（red）.

圖4分別為ZnO NP（圖4A）和ZnO NP-gel（圖4B）的紅外光譜結(jié)果。兩者對(duì)比發(fā)現(xiàn)很多峰值的變化，相比于ZnO NP的圖譜，ZnO NP-gel的波數(shù)在754和618 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，來源于高分子結(jié)構(gòu)中亞甲基面內(nèi)搖擺振動(dòng)，該表征數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明ZnO水凝膠合成成功。

Fig.4 Infra-red spectrum of ZnO NP（A）and ZnO NP-gel（B）.

2.2 ZnO NP-gel載藥率和包封率

ZnO NP投入量M1為1.6 g，稱量最終產(chǎn)物M2為1.7833 g，取0.2 g ZnO NP-gel在500℃下煅燒，去除合成的水凝膠等有機(jī)組分，得到殘余ZnO NP M3為0.1529 g，通過公式計(jì)算載藥率為76.45%，包封率為85.22%。

2.3 ZnO NP-gel對(duì)梭曼的體外洗消能力的評(píng)價(jià)

不同濃度洗消劑的洗消效率結(jié)果如圖5A所示，兩組材料洗消效率均隨著濃度增加而增加；ZnO NP-gel組明顯高于ZnO NP組；在相同濃度下，ZnO NP-gel洗消效率始終高于未修飾的ZnO NP（n=3，P＜0.05，P＜0.01）。選取濃度為2 g·L-1測(cè)定不同時(shí)間的洗消效率，結(jié)果如圖5B所示，在整個(gè)洗消過程中，ZnO NP-gel的洗消率始終高于ZnO NP；ZnO NP-gel在20 min時(shí)達(dá)到50%的洗消率，而ZnO NP約80 min才能達(dá)到50%洗消率，前者較后者洗消一半毒劑的時(shí)間縮短了4倍；約120 min后ZnO NP-gel洗消效率趨于平緩，而ZnO NP洗消效率仍在增加；約420 min后，兩者接近，洗消率均趨于100%。

Fig.5 Decontamination efficiency of ZnO NP and ZnO NP-gel under different concentrations(A)and at different time points(B)in vitro.B was the result of one experiment.±s,n=3.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with ZnO NP.

2.4 ZnO NP-gel的梭曼減毒作用

表1結(jié)果顯示，給予梭曼ZnO NP-gel洗消液的小鼠未出現(xiàn)驚厥癥狀，且全部存活；而給予ZnO NP洗消梭曼的小鼠全部出現(xiàn)驚厥癥狀，死亡1只；未進(jìn)行洗消的梭曼組全部驚厥且死亡。

Tab.1 Detoxicative effect of ZnO NP-gel on soman exposued mice

3 討論

ZnO NP-gel材料的合成中，在ZnO NP表面添加不飽和雙鍵基團(tuán)制備為ZnO NP-戊烯酸，目的是使其不飽和基團(tuán)參與單體甲基丙烯酸-2（N，N-二甲基）乙酯的自由基聚合反應(yīng)，以N，N，N′，N′-四甲基二乙胺維持穩(wěn)定的弱堿性反應(yīng)環(huán)境，在過硫酸鉀的引發(fā)作用下促進(jìn)反應(yīng)生成，同時(shí)加入交聯(lián)劑N′，N′-亞甲基雙丙烯酰胺保證合成的材料更加穩(wěn)定。

在上述反應(yīng)的基礎(chǔ)上，成功合成ZnO NP-gel后，經(jīng)紅外光譜、X射線衍射、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡等測(cè)試，證明前述的反應(yīng)能夠?qū)⒏叻肿油耆揎椩赯nO的外層；經(jīng)計(jì)算，載藥率為76.45%；包封率為85.22%；zeta電位負(fù)值增加證明其在溶液中分散性更好。

通過對(duì)梭曼的聯(lián)苯胺反應(yīng)，測(cè)定所合成ZnO NP-gel的洗消效率。經(jīng)不同濃度洗消劑洗消效率對(duì)比可知，高分子修飾后的復(fù)合材料洗消效率明顯提高，證明外層高分子材料的修飾，可以增加其洗消能力。分析相同洗消劑濃度下不同時(shí)間點(diǎn)洗消效率可得知，ZnO NP-gel洗消一半梭曼的時(shí)間較ZnO NP縮短了4倍，該高效性考慮主要源于高分子材料對(duì)梭曼的快速吸附作用。水凝膠作為一種具有吸附作用的材料，溶解后的高分子鏈在水溶液中溶脹擴(kuò)散開，能迅速的捕獲分散在體系中的毒劑分子并牢牢吸附住，實(shí)現(xiàn)了對(duì)梭曼無(wú)死角的快速吸附和收集，使ZnO NP可以迅速?gòu)V泛接觸梭曼。同時(shí)，修飾高分子材料并沒有影響到內(nèi)核的ZnO NP自身催化活性，實(shí)現(xiàn)了ZnO NP的催化分解和外層高分子材料的強(qiáng)力吸附的復(fù)合洗消。這種迅速吸附和催化共同發(fā)揮作用的洗消效果更有利于洗消快速高效進(jìn)行；且修飾后的材料有著更好的溶液分散性，克服了ZnO NP分散性差的問題。

在該材料洗消梭曼的過濾液染毒小鼠的實(shí)驗(yàn)中，相較于ZnO NP組小鼠全部驚厥，ZnO NP-gel組的小鼠均未出現(xiàn)梭曼中毒癥狀，說明該材料能夠高效的洗消梭曼。同時(shí)，該材料可以用于神經(jīng)毒劑污染水源的清潔。在實(shí)戰(zhàn)環(huán)境下中，用ZnO NP-gel洗消染毒的水源，而后過濾，可以實(shí)現(xiàn)水源凈化，減少環(huán)境的污染。

神經(jīng)性毒劑洗消的目標(biāo)是追求快速、徹底的洗消且無(wú)二次污染?；诖藨?yīng)用需求，我們提出了修飾了高分子的金屬氧化物納米復(fù)合洗消材料：外層高分子發(fā)揮吸附毒劑作用的同時(shí)內(nèi)核發(fā)揮催化分解毒劑的能力。該新型材料比對(duì)應(yīng)的金屬氧化物洗消一半梭曼的時(shí)間縮短了4倍。該類型材料的構(gòu)建和合成方法，為新型洗消劑的研究提供了一個(gè)新的思路，同時(shí)更快速、高效的洗消劑的研究正在進(jìn)行中。

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