促血管生成素—2在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

楊文杰　劉尚瑩　陳強(qiáng)　王杰

【摘要】 目的：研究促血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義。方法：用免疫組化SP法檢測(cè)50例腎細(xì)胞癌組織、配對(duì)癌旁組織以及6例正常腎組織中的Ang-2，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行具體分析。結(jié)果：Ang-2在腎細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.0%（31/50）、28.0%（14/50）和0（0/6），三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ang-2在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為51.4%（19/37）和92.3%（12/13）；Ang-2在術(shù)前有血尿組和無(wú)血尿組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.7%（12/14）和52.8%（19/36），兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Ang-2在腎細(xì)胞癌組織表達(dá)明顯高于非癌組織，表明其在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與腎細(xì)胞癌的分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 腎細(xì)胞癌； 促血管生成素-2； 免疫組化

【Abstract】 Objective：To study the expression and significance of Ang-2 in renal cell carcinoma. Method：The expression of Ang-2 was measured by immunohistochemistry in tissue sections from 6 cases of normal renal tissues， 50 cases of RCC and their pericarcinous tissues，their correlation with clinical data features were analyzed.Result：The positive rate for expression of Ang-2 in RCC， their pericarcinous and normal renal tissue were respectively 62.0%（31/50），28.0%（14/50） and 0（0/6），the expression of Ang-2 in RCC was significantly higher than those in pericarcinous tissue and normal renal tissue，the difference was statistically significant among them（P<0.05）.The positive expression rates of Ang-2 in the stages of Ⅰ-Ⅱ and Ⅲ-Ⅳ were respectively 51.4%（19/37） and 92.3%（12/13），the positive expression rates of Ang-2 in the stages of Ⅲ-Ⅳ was higher than those in the stages of Ⅰ-Ⅱ；the positive expression rates of Ang-2 in patients with and without hematuresis were respectively 85.7%（12/14） and 52.8%（19/36），the positive expression rates of Ang-2 in RCC with hematuresis was higher than those without hematuresis，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The expression of Ang-2 in the RCC is higher than those in the noncancerous renal tissue，which indicates that it may play an important role during the development of RCC.It has relationship to RCC angiogenesis， clinical stage and metastasis.

【Key words】 Renal cell carcinoma； Angiopoietin-2； Immunohistochemical stain

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.005

腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，又稱(chēng)腎腺癌，簡(jiǎn)稱(chēng)腎癌。在我國(guó)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于膀胱癌，約占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。RCC起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，是一類(lèi)血管形成極為豐富的實(shí)性腫瘤，而新生血管形成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，促血管生成素（Angiopoietin，Ang）在腫瘤血管調(diào)控中起著重要作用。促血管生成素是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性酪氨酸激酶受體Tie-2的天然配體，目前發(fā)現(xiàn)的構(gòu)型有4種，其中Ang-2是腫瘤性血管新生起始的強(qiáng)化因素，與腫瘤血管的生成關(guān)系密切[2]。本研究探討Ang-2在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與患者性別、年齡、血尿及臨床分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科2013年1月-2014年12月間的50例腎癌手術(shù)切除標(biāo)本，所有腎癌患者術(shù)前均未行放、化療及免疫治療，且均為單側(cè)、單發(fā)，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為腎細(xì)胞癌。其中男28例，女22例；年齡34～78歲，中位年齡61歲；術(shù)前有血尿者為14例，無(wú)血尿者為36例；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）腎癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期20例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期4例。此外6例正常腎組織取自腎外傷及腎結(jié)石切除標(biāo)本。

1.2 試劑 兔抗人Ang-2多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用，步驟按說(shuō)明書(shū)。DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑取自山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理教研室。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復(fù)，滴加一抗置于37 ℃溫箱孵育1 h，滴加二抗并于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS液洗滌3次，DAB底物顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，樹(shù)脂膠封片，置于顯微鏡下觀察，使用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 本研究在光鏡下結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比判斷Ang-2在腎細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率。以腫瘤細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕褐色顆粒為Ang-2陽(yáng)性表達(dá)，染色愈濃代表陽(yáng)性表達(dá)愈強(qiáng)。選取背景清晰的視野，在100倍顯微鏡下觀察，按組織染色深淺分為：未染色記作0分；淺黃色記作1分；棕黃色記作2分；棕褐色記作3分。選取染色均勻的區(qū)域于400倍顯微鏡下觀察，記錄5個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，計(jì)算其平均值。按染色細(xì)胞的比例分為4分：0～25%記作0分；25%～50%記作1分；50%～75%記作2分；>75%記作3分。組織染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分比級(jí)別之和3～6分為陽(yáng)性，以上檢測(cè)采用盲法獨(dú)立檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，小樣本（n<40）比較采用Fishers精確概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-2在腎細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達(dá) 免疫組化學(xué)染色Ang-2主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜上（圖1），棕褐色顆粒狀為陽(yáng)性著色。50例RCC患者中Ang-2的陽(yáng)性表達(dá)率為62.0%（31/50），癌旁組織中Ang-2的陽(yáng)性表達(dá)率為28.0%（14/50），6例正常腎組織中Ang-2均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。RCC中Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織及正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率在癌旁組織與正常腎組織中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 Ang-2的表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系 在50例RCC患者中，男性組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為60.7%（17/28），女性組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為63.6%（14/22），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.01，P>0.05）；60歲以下組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為70.8%（17/24），60歲以上組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為53.8%（14/26），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=1.53，P>0.05）；術(shù)前有血尿組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為85.7%（12/14），術(shù)前無(wú)血尿組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為52.8%（19/36），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=4.64，P<0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為51.4%（19/37），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)率為92.3%（12/13），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=5.22，P<0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移都離不開(kāi)新生血管的生成，新生血管網(wǎng)給腫瘤提供充足的血液供應(yīng)、清除代謝產(chǎn)物的同時(shí)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中亦發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，豐富的新生血管不僅使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)會(huì)增加，而且可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵入鄰近的淋巴管，從而發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，此外新生血管的基底膜容易滲漏，腫瘤細(xì)胞易穿透血管基底膜而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。辛華等[4]研究表明，腫瘤在缺乏新生血管的情況下，其發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的可能性均較小。腫瘤誘發(fā)血管的聚集和生成與腫瘤細(xì)胞本身釋放的一類(lèi)促血管生成因子密切相關(guān)。腫瘤新生血管的生成是一個(gè)多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程，受多種血管生成因子及抑制因子的調(diào)控。促血管生成素（Angiopoietins，Ang）是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)具有受體促進(jìn)劑及抑制劑的促進(jìn)血管生成因子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，作用于Tie2受體，與其他血管生成促進(jìn)因子共同發(fā)揮作用，其中Ang-1、Ang-2與腫瘤血管生成的關(guān)系最為密切，其分子結(jié)構(gòu)相似，但生物學(xué)功能相反[5-6]。Ang-2基因位于8p23，編碼496個(gè)氨基酸，與Ang-1有近60%的同源性，與Tie2受體結(jié)合而發(fā)揮作用[7]。Ang-2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang-1與Tie2相互作用而參與到血管的重塑，破壞血管的穩(wěn)定性。在成人正常組織中，Ang-2分布于子宮、胎盤(pán)和卵巢等組織中，可能與上述組織生理過(guò)程中的血管重建有關(guān)[8]。但在病理情況下，Ang-2可表達(dá)于炎癥、創(chuàng)傷以及腫瘤部位，參與上述部位的血管重建及組織修復(fù)過(guò)程，而在腫瘤組織中的表達(dá)，可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲等密切相關(guān)[9]。

目前有關(guān)腫瘤生長(zhǎng)的研究認(rèn)為，在早期腫瘤細(xì)胞形成所需要的血供和機(jī)體正常組織血供為同一來(lái)源，相互競(jìng)爭(zhēng)，但由于腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)為高代謝、快速生長(zhǎng)，所以其競(jìng)爭(zhēng)血供的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于機(jī)體正常組織，為阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，機(jī)體則分泌Ang-2使腫瘤占據(jù)的血管發(fā)生退化，起到自殺性防御的作用[10]。所以早期血管不隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展而增生，而是發(fā)生退化，此時(shí)Ang-2高表達(dá)，而VEGF的表達(dá)無(wú)明顯變化[11]。后期由于腫瘤血管退化、血供減少，組織缺氧壞死，從而誘發(fā)VEGF的表達(dá)增加，同時(shí)Ang-2阻斷Ang-1的血管穩(wěn)定性作用，使血管內(nèi)皮對(duì)生長(zhǎng)因子的敏感性增強(qiáng)，促進(jìn)血管重建。所以后期腫瘤血管增生顯著，此時(shí)Ang-2及VEGF表達(dá)均明顯增多。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中原有成熟血管發(fā)生了退化，腫瘤新生血管開(kāi)始生成。Ang-2的表達(dá)增加可認(rèn)為是腫瘤血管新生的標(biāo)志，意味著腫瘤細(xì)胞的快速增長(zhǎng)并易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

在人體正常組織中，Ang-2僅存在于女性生殖系統(tǒng)等部分血管重建部位，而其他正常成熟組織中呈無(wú)表達(dá)或輕微表達(dá)。病理情況下，Ang-2表達(dá)上調(diào)已在胃癌、食管癌及肝癌等多種腫瘤中得以證實(shí)。在細(xì)胞癌變過(guò)程的早期，Ang-2的表達(dá)增多，與腫瘤侵襲性及患者預(yù)后不良有關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，Ang-2在RCC組織中的表達(dá)率較癌旁組織及正常腎組織明顯增高；Ang-2在血尿組中的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)血尿組；Ang-2在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組中的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示Ang-2的高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤血管的形成，進(jìn)而參與了RCC的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。

阻斷腫瘤血管的形成，從而切斷腫瘤細(xì)胞的血供來(lái)阻止其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，成為腫瘤研究和治療的一個(gè)熱點(diǎn)，由于腎細(xì)胞癌對(duì)放化療均不敏感，以Ang-2及其受體作為一個(gè)治療靶點(diǎn)在腎癌治療領(lǐng)域開(kāi)辟了一條新途徑[14-15]。Ang-2在人體正常組織中低表達(dá)，作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)使其對(duì)全身影響較小。腫瘤血管的生成是一個(gè)受多因素調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，Ang-2的表達(dá)與腫瘤新生血管的相互關(guān)系及其機(jī)制尚未完全清楚，將Ang-2作為靶點(diǎn)運(yùn)用于腫瘤治療任重而道遠(yuǎn)，需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]那彥群，葉章群，孫穎浩.中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南2014版[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：3-4.

[2] Ward E G，Grosios K，Markham A F，et al.Genomic structure of the Human angiopoietins show polymorphism in angiopoietin-2[J].Cytogenet Cell Genet，2001，94（3-4）：147-154.

[3] Liotta L A，Steeg P S，Stetle-Stevenson W J，et al.Cancer metastasis and angiogenesis：an imblanance of positive and negative regulation[J].Cell，1989，64（2）：327-336.

[4]辛華，鄭雅娟，王維忠.腫瘤細(xì)胞侵襲及血行轉(zhuǎn)移過(guò)程[J].中國(guó)腫瘤臨床，2004，31（9）：534-536.

[5] Deng P B，Hu C P，Xiong Z，et al.Treatment with EGCG in NSCLC leads to decreasing interstitial fluid pressure and hypoxia to improve chemotherapy efficacy through rebalance of Ang-1 and Ang-2[J].Chin J Nat Med，2013，11（3）：245.

[6] Fiedler U，Krissl T，Koidl S，et al.Angiopoietin-1 and Angiopoietin-2 share the same binding domains in the Tie-2 receptor involving the first Ig-likeloop and the epidermal growth factor-like repeats[J].Bid Chem，2003，278（3）：1721.

[7] Lai T，Li M，Zheng L，et al.Over-expression of VEGF in marrow stromal cells promotes angiogenesis in rats with cerebral infarction via the synergistic effects of VEGF and Ang-2 [J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（5）：724.

[8] Rennel E S，Regula J T，Harper S J，et al.A human neutralizing antibody specific to Ang-2 inhibits ocular angiogenesis[J].Microcirculation，2011，18（7）：598.

[9] Dellinger M，Hunter R，Bernas M，et al.Defective remodeling and maturation of the lymphatic vasculature in Angiopoietin-2 deficient mice[J].Dev Boil，2008，319（2）：309.

[10] Holash J，Wiegand S J，Yancopoulos G D，et al.New model of tumor angiogenesis dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene，1999，18（38）：5356-5362.

[11] Holash J，Maisonpieire P C，Compton D，et al.Vessel cooption regress and growth in tumors mediated by angiopoietin and VEGF[J].Science，1999，284（5422）：1994-1998.

[12] Hawighorst T，Skobe M，Streit M.Activation of the Tie2 receptor by angiopoietin-1 enhances tumor vessel maturation and impair squamous cell carcinoma growth[J].Am J Pathol，2002，160（4）：1381.

[13] Ochiumi T，Tanaka S，Oka S，et al.Clinical significance of angiopoietin-2 expression at the deepest invasive tumor site of advanced colorectal carcinoma[J].Int J Oncol，2004，24（3）：539.

[14] Peter M，Robert F，Jean B.Renal cell carcinoma：recent progress and future directions[J].Cancer Research，1997，57（11）：5185-5189.

[15] Tian G，Dawson N.New agents for the treatment of renal cell carcinoma[J].Expert Rev Anticancer Ther，2001，1（4）：546-564.

（收稿日期：2015-07-21） （本文編輯：周亞杰）