蜈蚣敗毒飲藥物血清對銀屑病HaCaT細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響

楊素清 劉暢　張海龍　安月鵬

摘要：目的 探討蜈蚣敗毒飲對銀屑病HaCaT細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、核因子-κB（NF-κB）mRNA表達的影響。方法 實驗大鼠隨機分為空白對照組、西藥對照組、中藥對照組和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量組，分別給予生理鹽水、甲氨蝶呤混懸液、復(fù)方青黛膠囊混懸液和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量濃縮液灌胃，制備相應(yīng)的藥物血清，將其分別作用于HaCaT細胞中培養(yǎng)傳代，采用RT-PCR法檢測不同藥物血清對目的基因表達的干預(yù)作用。結(jié)果 各組藥物血清均能夠降低HaCaT細胞Bcl-2、NF-κB mRNA的表達，蜈蚣敗毒飲高劑量組和西藥對照組的作用效果最為明顯，且蜈蚣敗毒飲各劑量組呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)論 蜈蚣敗毒飲可能通過降低Bcl-2、NF-κB mRNA的表達促進了HaCaT細胞凋亡，調(diào)控T細胞相關(guān)因子降低免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗銀屑病樣的作用。

關(guān)鍵詞：銀屑病；蜈蚣敗毒飲；HaCaT細胞；細胞凋亡抑制因子；核因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.016

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0055-04

Effects of Wugong Baidu Drink Drug-containing Serum on Expressions of Genes Related to the Apoptosis of HaCaT Cell in Psoriasis YANG Su-qing， LIU Chang， ZHANG Hai-long， AN Yue-peng （First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To discuss effects of Wugong Baidu Drink on expressions of Bcl-2， NF-κB mRNA genes related to the apoptosis of HaCaT in psoriasis. Methods Wistar rats were randomly divided into 6 groups：blank group， Western medicine control group， TCM control group， and Wugong Baidu Drink high， medium， and low dose groups. They were given normal saline， methotrexate suspension， compound natural indigo capsule suspension， and the different doses of Wugong Baidu Drink for gavage， respectively. Drug-containing serum of each group was prepared， and was put in the HaCaT respectively to subculture. The intervention effect of different Drug-containing serums on expressions of objective genes were detected through PR-PCR method. Results Drug-containing serum of each group could decrease the expressions of Bcl-2 mRNA and NF-κB mRNA. The most obvious effects were shown in the groups of Western medicine control group and Wugong Baidu Drink high dose group. All Wugong Baidu Drink groups showed a dose-response relationship. Conclusion Wugong Baidu Drink probably can promote the apoptosis of HaCaT by reducing the gene expressions of Bcl-2 and NF-κB. It can also decrease immune response by regulating serum factors related to T cells to play the role of anti-psoriasis.

Key words：psoriasis；Wugong Baidu Drink；HaCaT cell；inhibiting factor of apoptosis；nuclear factor

銀屑病是一種常見的、反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病，目前普遍認(rèn)為其發(fā)病機制與HaCaT的高度異常

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12531619）

通訊作者：安月鵬，E-mail：anyuepeng_021@163.com

增殖密切相關(guān)[1]，因HaCaT細胞的加速增殖，導(dǎo)致表皮更替時間縮短，從而導(dǎo)致皮膚角化過度及紅斑、鱗屑等現(xiàn)象產(chǎn)生。我們前期對HaCaT細胞增殖相關(guān)基因角蛋白-6（Keratin-6）進行研究發(fā)現(xiàn)，這種基因的表達水平與表皮細胞的增殖存在正相關(guān)作用[2]。但皮膚細胞的代謝是增殖和凋亡雙方面調(diào)控的共同結(jié)果，在與表皮細胞凋亡相關(guān)基因中，細胞凋亡抑制基因Bcl-2和核因子-κB（NF-κB）起到了十分重要的作用，均可通過表達而抑制細胞凋亡，延長HaCaT細胞的壽命，導(dǎo)致表皮增厚，最終形成銀屑病樣反應(yīng)。故本研究選擇以上2種基因的表達作為研究對象，同時結(jié)合蜈蚣敗毒飲組方依據(jù)的中醫(yī)毒瘀理論，探討中藥對于銀屑病表皮細胞“抑制增殖”和“促進凋亡”的雙向調(diào)控機能。

1 實驗材料

1.1 動物與細胞株

雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，鼠齡6～8周，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供（動物合格證號：醫(yī)動字第09-3-3號）；HaCaT細胞株來源于武漢大學(xué)實驗保藏中心。

1.2 試劑

無菌蒸餾水（TA6007，北京天安聯(lián)合科技有限公司），異丙醇、氯仿、戊巴比妥鈉、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS，濟南世紀(jì)通達化工有限公司），Trizol Reagent、DEPC、引物設(shè)計合成（上海浩然生物技術(shù)有限公司），DL2000 DNA Marker、TransScript Reverse Transcriptase（上海捷瑞生物工程有限公司），2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板（美國康寧公司），細胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司），DMEM培養(yǎng)基（上海慧穎生物科技有限公司），超低溫冰箱（8600，美國Thermo Scientific），倒置顯微鏡（CX22，日本Olympus），電泳儀（TE70X，美國Hoefer），高速低溫離心機（MR18.2，德國Herolab），臺式離心機（XPN-100，美國Optima），凝膠成像分析系統(tǒng)（MSD-2000A，北京麥思奇高科技有限公司），PCR儀（PQ9000，德國analytikjena），超凈工作間（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中基實驗室）。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

蜈蚣敗毒飲（蜈蚣3 g、紫草30 g、鬼箭羽30 g、土茯苓30 g、烏梢蛇20 g、甘草10 g，藥物均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診草藥局），藥物經(jīng)2次煎煮，先加8倍量水，經(jīng)4 h浸泡后煎煮1 h，再加6倍量水煎煮1 h，2次煎汁混合均勻，分別濃縮為濃度5.94、2.97、1.48 g/mL。甲氨蝶呤片（批號070803，上海信誼藥廠有限公司），取15 mg溶于134.41 mL無菌蒸餾水，配制0.11 mg/mL甲氨蝶呤混懸液；復(fù)方青黛膠囊（批號201207013，陜西醫(yī)藥控股集團），取18 g藥物劑量的膠囊制劑溶解于134.43 mL的無菌蒸餾水，配制成0.13 g/mL復(fù)方青黛膠囊混懸液。

2.2 藥物血清提取

將Wistar大鼠隨機分為空白對照組、西藥對照組、中藥對照組和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量組，每組6只?？瞻讓φ战M灌服生理鹽水，西藥對照組灌服甲氨蝶呤混懸液，中藥對照組灌服復(fù)方青黛膠囊混懸液，蜈蚣敗毒飲低劑量組、中劑量組、高劑量組灌服相應(yīng)濃度的蜈蚣敗毒飲濃縮液。灌服劑量均為每日2 mL/100 g，每日2次，連續(xù)3 d。末次給藥后，大鼠戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，取腹主動脈血靜置后3000 r/min離心5 min分離血清，取上層血清，經(jīng)56 ℃滅活，混勻，濾菌，分裝，保存。

2.3 細胞分組與給藥

將HaCaT細胞置于DMEM培養(yǎng)液中進行細胞培養(yǎng)，經(jīng)傳代、計數(shù)、凍存、復(fù)蘇等過程進行實驗用細胞的制備。將HaCaT細胞隨機分成6組，并取細胞以2×104/mL接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL，培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細胞已貼壁生長良好，再吸棄上清液和沒有貼壁的細胞，分別給予空白血清、甲氨蝶呤藥物血清、復(fù)方青黛膠囊藥物血清和蜈蚣敗毒飲低、中、高劑量血清于6個瓶中，并按照比例加入胎牛血清、DMEM，使其與藥物血清的比例保持在1∶8∶1，處理48 h。

2.4 觀察指標(biāo)和檢測方法

2.4.1 RNA提取及檢測 應(yīng)用Trizol試劑盒提取細胞總RNA。將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液倒出，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細胞表面3次，按1 mL/25 cm2加入Trizol，反復(fù)吹打后移入新的DEPC處理過的Eppendorf管內(nèi)。室溫下孵育細胞5 min，使核蛋白完全碎裂。按照每1 mL Trizol加入0.2 mL的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩混勻30 s，室溫下孵育2～3 min，4 ℃、12 000 g離心10～15 min。Eppendorf管內(nèi)液體分為3層，小心吸取最上層的水性上清，加入異丙醇0.5 mL，顛倒混勻，室溫孵育10 min后，4 ℃、12 000 g離心10 min，RNA沉淀管底，呈膠凍狀。棄上清，保留沉淀，加入4 ℃的75%乙醇，每1 mL Trizol至少加入1 mL乙醇，并振蕩。2～8 ℃、7500 g離心5 min，小心吸棄上清后空氣干燥3～5 min，加入10 μL DEPC水，吹打溶解RNA，進行純度及完整性檢測，或凍存于-70 ℃冰箱備用。

2.4.2 第一鏈cDNA合成 加入總RNA 500 ng， Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，Ribonuclease Inhibitor（50 U/μL） 0.5 μL，TransScript RT 1 μL， ddH2O to final volume 20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育30 min。85 ℃加熱5 min失活。

2.4.3 聚合酶鏈反應(yīng) 引物：從美國NCBI數(shù)據(jù)庫下載mRNA序列，用Primer3.0引物設(shè)計軟件設(shè)計：Bcl-2（Forward primer：CTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCT； Reverse primer：CTCCAACCCCCGCATCTCGGAC；產(chǎn)物長度220 bp）；NF-κB（Forward primer：CGCCACCCGGCT TCAGAATGG；Reverse primer：TATGGGCCATCTGCTGTTGGC AG；產(chǎn)物長度148 bp）；ACTB（Forward primer：ACAGAG CCTCGCCTTTGCCGATC；Reverse primer：ATCCTTCTGACC CATGCCCACCA；產(chǎn)物長度208 bp）。反應(yīng)體系：Template DNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer（10 μmol/L） 1 μL；Reverse Primer（10 μmol/L） 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O to final volume 50 μL。PCR循環(huán)：94 ℃預(yù)變性4 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，連續(xù)30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

2.4.4 PCR產(chǎn)物分析 應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)對電泳后的凝膠進行觀察、拍照，測量各產(chǎn)物的光密度。以目的基因光密度值與同時擴增的內(nèi)參基因光密度比值表示目的基因的相對表達水平。實驗重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，多組計量資料的兩兩比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

與空白對照組比較，各藥物組對HaCaT細胞Bcl-2、NF-κB mRNA表達均有干預(yù)作用（P<0.05）；其中西藥對照組干預(yù)作用優(yōu)于除蜈蚣敗毒飲高劑量組外各給藥組（P<0.05），且蜈蚣敗毒飲高劑量組與西藥對照組藥效相當(dāng)（P<0.05）。蜈蚣敗毒飲各劑量組作用療效隨藥液濃度的增加而增強。通過凝膠電泳圖可以直觀看出兩目的基因的表達成像情況。

5 討論

銀屑病臨床突出表現(xiàn)為大量的紅斑、鱗屑堆積。以往對于銀屑病發(fā)病機制的研究多集中于對HaCaT細胞增殖機制的探討[3]，從正向思維認(rèn)為，增殖的過度必然會導(dǎo)致表皮堆積成厚層銀屑。但這僅僅是其中的一個方面，凋亡的抑制和減慢同樣可造成內(nèi)表皮細胞數(shù)量的增多而發(fā)病。

HaCaT細胞凋亡在皮膚發(fā)育和更新平衡穩(wěn)定中起著重要的作用，與其增殖密切相關(guān)。在正常表皮，角質(zhì)形成細胞增殖速率與凋亡速率相等，以維持表皮細胞的動態(tài)平衡。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，銀屑病中角質(zhì)形成細胞的凋亡受阻，其凋亡的減少可造成多余細胞堆積及角層增厚[4]。有學(xué)者比較了銀屑病來源的角質(zhì)形成細胞和正常人角質(zhì)形成細胞對凋亡反應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)銀屑病來源的角質(zhì)形成細胞對凋亡具有抵抗性[5]。細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展是多基因嚴(yán)格控制的過程，Bcl-2是第一個被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因，是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，也是細胞凋亡過程中的一類調(diào)節(jié)因子[6]。Bcl-2的表達可調(diào)節(jié)細胞對凋亡的易感性，增加細胞對多種凋亡刺激因素的抵抗性，抑制許多細胞的凋亡，同時，可延長具有分化潛能的上皮細胞的壽命且允許增殖、分化和形態(tài)發(fā)生發(fā)展，從而導(dǎo)致表皮增厚。NF-κB在銀屑病發(fā)病過程中亦起到了關(guān)鍵的作用，實驗研究表明，NF-κB介導(dǎo)的對細胞凋亡的抑制包括誘導(dǎo)超氧化物歧化酶表達、誘導(dǎo)凋亡抑制因子表達這兩個主要功能[7]，同時，NF-κB亦具有調(diào)控T淋巴細胞所介導(dǎo)的多種細胞因子及黏附分子表達的作用，通過干預(yù)這些血清學(xué)因子的含量從而影響銀屑病的發(fā)展發(fā)生[8]。

本研究結(jié)果顯示，甲氨蝶呤、復(fù)方青黛膠囊、蜈蚣敗毒飲藥物血清均有降低HaCaT細胞Bcl-2、NF-κB mRNA表達的作用，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；同時，蜈蚣敗毒飲高劑量組和西藥對照組的作用效果明顯優(yōu)于其他各藥物組，并且蜈蚣敗毒飲藥物血清的作用強度隨著濃度的增高而表現(xiàn)出一定的不典型量效關(guān)系。因此我們推測，基于中醫(yī)毒瘀理論而創(chuàng)立的蜈蚣敗毒飲在中醫(yī)學(xué)角度上可以產(chǎn)生良好的解毒化瘀之效，將熱毒、濕毒、瘀毒隨因而解，以防疾病的轉(zhuǎn)化和變歸。而在病因?qū)W角度其發(fā)揮抗銀屑病作用機制方面，一是可能與抑制了HaCaT細胞增殖相關(guān)；另一方面是通過降低Bcl-2、NF-κB基因的表達，促進了HaCaT細胞凋亡；再者，與其干預(yù)和調(diào)節(jié)T淋巴細胞相關(guān)因子，降低免疫反應(yīng)有關(guān)。蜈蚣敗毒飲通過多途徑、多靶點的作用機制來達到治療銀屑病的目的，體現(xiàn)出中醫(yī)藥的多點優(yōu)勢和雙向調(diào)控作用。

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（收稿日期：2014-06-29；編輯：華強）