蒼耳子炮制前后植物蛋白含量的比較研究

武子敬，徐佳新，李明達(dá)，朱成光

蒼耳子（Fructus xanthii）為菊科植物，味甘，溫，有小毒，歸肺經(jīng)，具有散寒通竅祛濕的功效，用于治療風(fēng)疹頭痛，鼻塞流涕，鼻鼾等，為鼻淵頭痛之要藥［1］.植物蛋白有多種藥理作用，如抗氧化活性、抗菌活性，還具有一定免疫活性等［2］.蒼耳子有小毒，其植物蛋白又是其毒性成分之一，本實(shí)驗(yàn)以蒼耳子中植物蛋白作為研究?jī)?nèi)容，考察炮制前后植物蛋白含量變化，以便為蒼耳子在臨床應(yīng)用方面提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下.

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 試藥

中藥材：購(gòu)于通化市醫(yī)藥大廈的蒼耳子藥材.

試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250（購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛血清蛋白對(duì)照品（批號(hào)：20180808）；乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；硝酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）.

1.2 儀器

可控調(diào)溫電爐（郫縣永信電器廠）；BCD-265（KG28EV2S0C）型冰箱（博西華家用電器有限公司）；電子天平（深圳市無(wú)限量衡器有限公司經(jīng)銷）；分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；玻璃試管；高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）.

2 方法與結(jié)果

2.1 制備炮制品

生品：取原藥材5 g，除去雜質(zhì)，用時(shí)粉碎.

炒品：取凈蒼耳子5g置炒制容器內(nèi)，用中火加熱翻炒至黃褐色，刺焦時(shí)即可取出，碾去刺篩凈.

2.2 定性鑒別

（1）硝化反應(yīng).分別取蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液和加入蒼耳子炮制品粉末的樣品溶液5 mL放置于試管里，加入2 mL濃硝酸后，靜置5 min，觀察二者的顏色變化，結(jié)果顯示，加入蒼耳子的樣品溶液呈棕黃色，蛋白質(zhì)對(duì)照品呈現(xiàn)黃色，基本保持一致，說(shuō)明其蒼耳子中含有蛋白質(zhì).另取一支試管，加入5 mL純化水，同樣加入2 mL濃硝酸，靜置5 min觀察顏色變化，結(jié)果顯現(xiàn)白色，無(wú)明顯變化.

（2）色譜鑒別.陽(yáng)性對(duì)照：取濃度為10 mg·L-1蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液5 mL，加入雙縮脲試劑5 mL，震蕩均勻后顯現(xiàn)紫色；供試品溶液：取5 g蒼耳子樣品置試管中，并向5 g蒼耳子的樣品的試管中加入純化水10 mL，超聲過(guò)濾收集濾液水，濾液濃縮5 mL，加入雙縮脲試劑5 mL，震蕩均勻，顯現(xiàn)紫色；陰性樣品溶液：取純化水5 mL，加入雙縮脲試劑5 mL，震蕩均勻，呈淺藍(lán)色.此外，需要取這3種染色液，相應(yīng)試劑為空白，在紫外分光光度儀400～700 nm波長(zhǎng)處掃描，均有最大吸收峰位于540 nm處，陰性樣品溶液在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)最大吸收.

2.3 定量檢測(cè)

（1）溶液的制備［3-4］.

①精密稱取0.438 g NaCl溶于50 mL容量瓶中，再加純化水，定容前檢查裝置是否漏水，然后倒轉(zhuǎn)和搖動(dòng)的方法使瓶?jī)?nèi)液體混合，配好0.15 mol·L-1NaCl的溶液.

②取考馬斯亮藍(lán)G-250 50 mg，放入燒杯，加入25 mL乙醇，50 mL磷酸，注意要混勻，然后加入純化水，慢慢將其稀釋至500 mL，所制得的溶液為考馬斯亮藍(lán)G-250的染色液，以備實(shí)驗(yàn)所用.

③選用電子天平稱取牛血清蛋白25 mg，放于25 mL容量瓶中，用純化水溶解后，定容，即得，放于4℃下放置在冰箱中保存.取該溶液0.2 mL，加0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，再加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 mL，混合均勻后，大約放5 min，得到蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液.

④取蒼耳子炮制品粉末0.1g，加入0.15mol·L-1NaCl溶液到2 mL，此處一定要記得利用超聲波進(jìn)行溶解，加入考馬斯亮藍(lán)10.0 mL，混合均勻，放置大約5 min，等待反應(yīng).

⑤取2 mL的0.15 mol·L-1NaCl溶液，10.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，混合，放置一段時(shí)間，待其充分反應(yīng)，得到的是空白樣品溶液.

（2）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇.上述配制的5種溶液，除了0.15 mol·L-1NaCl溶液和考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，其余三種分別放置于紫外分光光度儀上掃描，設(shè)定一個(gè)固定波長(zhǎng)圍為500～700 nm，記錄蛋白質(zhì)對(duì)照品和樣品溶液在595 nm處有最大吸收，即設(shè)定波長(zhǎng)為595nm，如圖1～圖3.

圖1 蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液紫外吸收譜

圖2 樣品溶液紫外吸收譜

圖3 空白樣品溶液紫外吸收譜

（3）曲線方程的建立.分別精密稱取蛋白質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL放置于10 mL試管中，每管加0.15 mol·L-1的NaCl溶液至1.0 mL，混和均勻.分別取0.1 mL上述各個(gè)試管中的溶液放置于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液染色液5.0 mL放置一段時(shí)間，即得到相應(yīng)毫升中所含蛋白質(zhì)含量.分別放于595 nm處測(cè)定吸光度值，讀取5次，取其平均值，濃度值為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，曲線方程：Y=0.284X+0.569 8（r=0.997 2），標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液3.62～18.25 mg·mL-1呈良好線性關(guān)系.

（4）精密度試驗(yàn).分別取蛋白質(zhì)對(duì)照品和空白樣品溶液，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值數(shù)次，重復(fù)多次，才會(huì)使結(jié)果更加接近準(zhǔn)確，算得結(jié)果RSD為1.24%，表明儀器精密度良好.

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn).主要考察所要測(cè)的蛋白質(zhì)在一段時(shí)間內(nèi)是否穩(wěn)定，那么取經(jīng)過(guò)染色后的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液，595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，但是要分別放置30 min、60 min、120 min、180 min、360 min，結(jié)果算得RSD為1.86%，表明供試品溶液在360 min內(nèi)穩(wěn)定.

（6）重復(fù)性試驗(yàn).取蒼耳子炮制品粉末0.1 g，加入0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，此處一定要記得利用超聲波進(jìn)行溶解，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 mL，混合均勻，放置大約5 min，等待反應(yīng)充分得樣品溶液.取該溶液5份，595 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出樣品含量，算得結(jié)果為RSD為1.43%.表明此方法重復(fù)性良好.

（7）回收率試驗(yàn).多次稱取固定含量的蒼耳子炮制品1 g放置于試管中，分組編號(hào)，然后按樣品含量的不同百分比，如60%、90%、120%加入蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液.加入0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，利用超聲波進(jìn)行溶解，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 mL，混合均勻，放置大約5 min，等待反應(yīng)充分得樣品溶液，再取空白溶液于相同波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，計(jì)算含量，得回收率為95.4%，表明該方法準(zhǔn)確度較高.

（8）含量測(cè)定.精密吸取蒼耳子炮制品粉末0.1 g放置于試管中，各3份，按照最開始的方法制備樣品溶液，同樣要取空白樣品溶液595 nm處測(cè)定吸光度值，見表1.

表1 樣品含量表（±s，n=3）

表1 樣品含量表（±s，n=3）

RSD/%1.21 1.34樣品炒制蒼耳子生品蒼耳子樣品含量1.02 1.04

本實(shí)驗(yàn)研究表明，炮制前后的蒼耳子中植物蛋白的含量有所變化，炮制后的蒼耳子中植物蛋白的含量的變少.

3 討論與結(jié)論

考馬斯亮藍(lán)法的檢測(cè)原理是基于染料考馬斯藍(lán)G250和蛋白質(zhì)之間形成的特異性結(jié)合，是最常用的測(cè)蛋白質(zhì)含量的方法中比較不受干擾的一種［4］.而雙縮脲試劑是目前首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法，其原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下與二價(jià)銅離子（Cu2+）作用生成藍(lán)紫色的化合物，這種顏色反應(yīng)強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量成正比，經(jīng)與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得蛋白質(zhì)含量［3］.

利用雙縮脲試劑、考馬斯亮藍(lán)法能快速測(cè)得植物蛋白中的含量.本實(shí)驗(yàn)研究表明，炮制前后的蒼耳子中植物蛋白的含量有所變化，炮制后的蒼耳子中植物蛋白的含量變少，而蒼耳子毒蛋白為其毒性成分之一［5］，其現(xiàn)代炮制方法有凈制、炒制，蒼耳子藥用必須炒焦黃，由于加熱炮制后脂肪中蛋白變性，而不被溶解，達(dá)到減毒的目的，盛昌翠［6］、張婷婷［7］通過(guò)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)蒼耳子炒制品毒性較生品降低，本實(shí)驗(yàn)研究首次從植物蛋白的角度考察蒼耳子的炮制意義，為蒼耳子的開發(fā)和利用提供了更好的依據(jù).同時(shí)，可以從植物蛋白的角度重新審視中藥炮制在中藥發(fā)展的重要作用，也為中藥炮制品的發(fā)展提供新的研究思路.