高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬血中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶

楊挺 許秀琴 趙健 章豪 吳銀良 王立君 朱勇

摘要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測(cè)定豬血中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的方法。樣品中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶用乙腈提取，UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。分析時(shí)采用Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.10%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正電子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明：鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)，峰面積與含量呈線性相關(guān)。鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的檢出限均為0.20 μg/kg，樣品中添標(biāo)回收率在85%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；鹽酸可樂(lè)定；鹽酸賽賡啶；豬血

Determination of Clonidine Hydrochloride and CyproheptadineHydrochloride in Swine Blood by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YANG Ting，XU Xiuqin， ZHAO Jian， ZHANG Hao，WU Yinliang， WANG Lijun， ZHU Yong

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China）

Abstract： A simple and sensitive ultra performance liquid chromatography-tandem mass （UPLC-MS/MS） method for the determination of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride in swine blood was developed. Samples were extracted with acetonitrile and analyzed by UPLC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution. Detection was carried out with an electrospray ionisation （ESI） probe and operated in the positive ion mode. Clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride was quantified by the external standard method. There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L. The limits of detection for clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride were both 0.2 μg/L. The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 110% and the relative standard deviations （RSD） were lower than 10%.

Key words： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； clonidine hydrochloride； cyproheptadine hydrochloride； swine blood

中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001

鹽酸可樂(lè)定（clonidine hydrochloride，C9H9Cl2N3·HCl）和鹽酸賽庚啶（cyproheptadine hydrochloride，C21H21N·HCl）通常作為人用藥品[1]。鹽酸可樂(lè)定主要用于治療高血壓、高血壓急癥、偏頭痛、絕經(jīng)期潮熱、痛經(jīng)等癥狀，鹽酸賽庚啶主要用于治療蕁麻疹、濕疹、過(guò)敏性和接觸性皮炎、皮膚瘙癢、鼻炎、偏頭痛、支氣管哮喘等癥[2-3]。自發(fā)現(xiàn)將可樂(lè)定添加于飼料中，可以促進(jìn)豬的生長(zhǎng)，并提高瘦肉率，賽庚啶也有一定的刺激食欲的功能后[4]，有發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)畜產(chǎn)品養(yǎng)殖者將這兩種藥物濫用于飼料中，以促進(jìn)豬的生長(zhǎng)[5-8]。這種濫用，勢(shì)必會(huì)對(duì)人類的健康帶來(lái)危害，曾發(fā)生過(guò)可樂(lè)定的中毒事件[9-11]，造成34人出現(xiàn)頭暈、昏迷并入院治療。農(nóng)業(yè)部于2010年12月27日發(fā)布1519號(hào)公告，禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶。目前，對(duì)于鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的測(cè)定主要集中于醫(yī)藥領(lǐng)域[12-13]。陳其煌[1， 14]測(cè)定了豬尿和豬肝中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶，曹瑩[15-16]、李丹妮[4]等測(cè)定了飼料中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶?？鹿饷鞯萚17]測(cè)定了家兔血液中的可樂(lè)定含量，孫成文等[18]測(cè)定了人血中的可樂(lè)定含量。由此可以看出，可樂(lè)定等藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)以后，會(huì)在血液中呈現(xiàn)出一定的濃度，因此，通過(guò)測(cè)定血液中藥物的濃度，便可知藥物是否在動(dòng)物體內(nèi)存在。從活體動(dòng)物抽血檢測(cè)并不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成很大的影響，因此測(cè)定活體動(dòng)物的血液可有效的解決獸藥殘留檢測(cè)的時(shí)滯性問(wèn)題。本研究采用了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測(cè)定豬血中的可樂(lè)定和賽庚啶含量，檢測(cè)限低準(zhǔn)確度高，旨在為豬血樣品中可樂(lè)定和賽庚啶的測(cè)定提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血為抽取的生豬血液，生豬來(lái)源于浙江奉化滕頭村養(yǎng)豬場(chǎng)。

鹽酸可樂(lè)定標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈（色譜純）美國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水為Mili Q超純水儀所制超純水；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-XEVO超高效液相色譜質(zhì)譜儀美國(guó)Waters 公司；SIGMA3K15離心機(jī)北京博勵(lì)行有限公司；RT SPE全自動(dòng)固相萃取儀美國(guó)Caliper公司；Mili Q 超純水儀美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg定容至100mL甲醇中，質(zhì)量濃度為100mg/L，―18℃保存，保質(zhì)期為6 個(gè)月。用甲醇稀釋為20.0 mg/L的中間液。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用流動(dòng)相（甲醇：0.1%甲酸水=20：80）稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液20.0mg/L的鹽酸可樂(lè)定、鹽酸賽庚啶分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2樣品前處理

吸取血漿樣品1.0 mL，渦旋30s，加入乙腈5 mL，渦旋3 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用0.2μm濾膜過(guò)濾，于50℃水浴用氮?dú)饬鞔蹈伞堅(jiān)昧鲃?dòng)相溶解后，過(guò)0.2μm濾膜，待測(cè)。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1min；3.5min，50%B保持1.4 min。流速：0.2mL/min，柱溫箱溫度：25℃；進(jìn)樣量10μL。

1.3.4質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；正離子方式檢測(cè)，采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。噴霧毛細(xì)管電壓1.5kV，離子源溫度150℃，去溶劑氣溫度500℃，去溶劑氣流速為1000L/h，碰撞氣流速0.20 mL/min，放大倍數(shù)為600。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件MassLynx version 4.1進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

根據(jù)鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的化學(xué)性質(zhì)及參考文獻(xiàn)[19-20]，選擇用乙腈來(lái)提取豬血中的可樂(lè)定和賽庚啶。

2.2 液相色譜的測(cè)定結(jié)果

用1000μg/L的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶溶液來(lái)確定合適的離子。最終確定了鹽酸可樂(lè)定的母離子為230.16，子離子為171.79、159.75；鹽酸噻庚啶的母離子為288.8，子離子為191.2、215.2。圖3為鹽酸可樂(lè)定和鹽酸噻庚啶的標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品和空白樣品色譜圖。

1.鹽酸噻庚啶的色譜圖（母離子288.8，子離子191.2）；2.鹽酸噻庚啶的色譜圖（母離子288.8，子離子215.2）；

3.鹽酸可樂(lè)定的色譜圖（母離子230.16，子離子171.79）；4.鹽酸可樂(lè)定的色譜圖（母離子230.16，子離子159.75）。

圖1 可樂(lè)定賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）、可樂(lè)定賽庚啶加標(biāo)樣品（b）、空白樣品（c）色譜圖

Fig. 1 MRM Chromatograms of standard solution of clonidine hydrochloride and cyproheptadine hydrochloride （a）， fortified sample （b）， and blank sample （c）

由圖1可知，空白樣品于峰位置處無(wú)吸收峰，說(shuō)明空白樣品不含鹽酸可樂(lè)定和鹽酸噻庚啶，對(duì)樣品的測(cè)定無(wú)干擾；加標(biāo)樣品的峰位置與標(biāo)準(zhǔn)溶液峰位置完全吻合，說(shuō)明此方法可以很好的用于測(cè)定鹽酸可樂(lè)定和鹽酸噻庚啶。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定，以鹽酸可樂(lè)定和鹽酸噻庚啶的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示：鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=4270.2x+18352（R2=0.9986），y=4118.8x+6156.2（R2=0.9978）。在質(zhì)量濃度內(nèi)線性范圍良好。

2.4 檢出限和定量限

根據(jù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的結(jié)果，配制相近質(zhì)量濃度的陽(yáng)性添加樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行操作，測(cè)定其實(shí)際信噪比。以信噪比RS/N=3為檢測(cè)限，以信噪比RS/N=10為定量限。結(jié)果表明，豬血樣品中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的檢出限均為0.2μg/L，定量限均為0.6μg/L。

2.5精密度和回收率

取豬血樣品1mL，制成1.0、2.0、4.0μg/L的加標(biāo)樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平重復(fù)3次，每次每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行添加樣品，取其平均值進(jìn)行定量分析。

加標(biāo)質(zhì)量濃度

/（μg/L）

測(cè)定值

/（μg/L）

回收率/% 精密度/%

批內(nèi) 批間

1.0 0.94±0.06 94 5.7 5.7

0.88±0.08 88 3.2 5.3

0.91±0.07 91 2.9 2.9

2.0 1.85±0.06 93 3.5 3.5

1.88±0.09 94 4.8 5.0

1.92±0.08 96 3.2 3.2

4.0 4.08±0.13 102 1.5 1.5

3.89±0.09 97 1.7 3.6

3.91±0.06 98 1.2 1.2

加標(biāo)質(zhì)量濃度

/（μg/L） 測(cè)定值

/（μg/L）

回收率/% 精密度/%

批內(nèi) 批間

1.0 0.95±0.07 95 5.8 5.8

0.86±0.09 86 4.9 6.1

0.92±0.06 92 3.2 3.2

2.0 1.86±0.06 93 3.9 3.9

1.89±0.09 95 4.2 5.4

1.91±0.08 96 5.1 5.1

4.0 4.09±0.11 102 2.6 2.6

3.62±0.08 91 3.7 4.9

3.75±0.09 94 2.9 2.9。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了一種豬血樣品中鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶的測(cè)定方法。利用乙腈作為提取液，過(guò)膜后用UPLC-MS/MS法測(cè)定。應(yīng)用這種方法測(cè)定豬血中的鹽酸可樂(lè)定和鹽酸賽庚啶，簡(jiǎn)便、快捷，檢出限低，回收率高，為豬血中可樂(lè)定和賽庚啶的測(cè)定提供了可靠的技術(shù)手段。

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