“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)建議

[摘 要]在做“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都被染成紅色。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的分析，提出以下改進(jìn)方法：染料要過(guò)濾，以免視野中出現(xiàn)顆粒雜質(zhì);人的口腔上皮細(xì)胞直接染色觀察，不需鹽酸水解;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的鹽酸溶液水解洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3清洗。

[關(guān)鍵詞]DNA RNA 實(shí)驗(yàn) 改進(jìn)建議

一、教材對(duì)該實(shí)驗(yàn)的處理過(guò)程及存在問(wèn)題

教材對(duì)該實(shí)驗(yàn)的處理過(guò)程為：取人的口腔上皮細(xì)胞（或洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞）制片，將裝片放在酒精燈火焰上烘干固定，放入裝有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸溶液的小燒杯中，再將小燒杯置于裝有30℃溫水的大燒杯中保溫5min，接著用蒸餾水沖洗載玻片10s，吸去水分后滴加甲基綠吡羅紅染色劑染色5min，然后蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察。

學(xué)生嚴(yán)格根據(jù)教材的設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不理想。主要存在問(wèn)題：人的口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均被染成紫紅色。洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)效果較好些，但染色效果不明顯，視野內(nèi)有顆粒雜質(zhì)。

二、對(duì)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題的分析及解決方法

（一）實(shí)驗(yàn)原理分析

該實(shí)驗(yàn)的原理：DNA主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，RNA大部分存在細(xì)胞質(zhì)中。堿性染料甲基綠吡羅紅對(duì)DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，而吡羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。利用甲基綠吡羅紅混合染色劑將細(xì)胞染色，可以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布。該反應(yīng)對(duì)pH敏感，同時(shí)染料純度、結(jié)合力、實(shí)驗(yàn)溫度都會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)效果。

（二）解決方法

1.觀察人的口腔上皮細(xì)胞DNA和RNA的分布

學(xué)生按照教材的實(shí)驗(yàn)步驟（制片、水解、沖洗、染色、觀察）操作，發(fā)現(xiàn)不僅口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，連細(xì)胞核也被染成紫紅色。查閱有關(guān)文獻(xiàn)，綜合分析可能有三個(gè)原因：其一，鹽酸水解改變口腔細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性，加速染色劑進(jìn)入細(xì)胞，但鹽酸使細(xì)胞中的DNA變性，因而DNA無(wú)法與甲基綠結(jié)合發(fā)生綠色反應(yīng)。其二，只有在染液的pH值為4.8時(shí)，甲基綠和吡羅紅才能對(duì)所染的材料都具有親和力，從而獲得最佳的染色效果。[1]遺留的鹽酸改變了染色劑的pH，從而使細(xì)胞核染色失敗。其三，DNA在高溫條件下易變性，酒精燈火焰溫度在500℃左右，直接將裝片置于火焰上烘烤，可能導(dǎo)致DNA變性，從而與吡羅紅結(jié)合呈現(xiàn)紅色。

綜上所述，建議將實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為：制片，且不用酒精燈烘干，不經(jīng)過(guò)鹽酸水解和蒸餾水沖洗，直接染色觀察。

2.觀察洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞DNA和RNA的分布

學(xué)生將實(shí)驗(yàn)材料換成洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞，重復(fù)教材中的實(shí)驗(yàn)步驟，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)效果較人的口腔上皮細(xì)胞好些。其優(yōu)勢(shì)有：其一，口腔上皮細(xì)胞較小，在低倍鏡較難觀察，而洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞較大，在低倍鏡下清晰可見(jiàn)，所以實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，且取材方便。其二，用鹽酸水解細(xì)胞，能改變細(xì)胞膜的通透性，加速染色劑進(jìn)入細(xì)胞，縮短時(shí)間，同時(shí)使DNA與蛋白質(zhì)分離，有利于DNA與甲基綠結(jié)合。

但整個(gè)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象還是不明顯，有些細(xì)胞還出現(xiàn)破裂、質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，同時(shí)視野中有顆粒雜質(zhì)。主要原因有：第一，水解后用蒸餾水沖洗，且只沖洗10s，時(shí)間太短，可能使鹽酸殘留在細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的pH低于4.8，甲基綠染色劑不容易著色。所以用蒸餾水沖洗的表皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)紫紅色。第二，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸濃度過(guò)高，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)皺縮。第三，視野中的大量顆粒物質(zhì)可能是未溶解的染料，所以在實(shí)驗(yàn)前要將染料過(guò)濾。

綜上所述，建議將實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為：（1）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3溶液代替蒸餾水沖洗。用堿性的NaHCO3溶液中和多余的HCl，確保細(xì)胞中的pH不會(huì)低于4.8。（2）降低鹽酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)查閱，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的鹽酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)效果較佳。[2]（3）將染液過(guò)濾，可提高視野內(nèi)的潔凈度，同時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的改變。[3]

三、改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

（一）觀察人口腔上皮細(xì)胞DNA和RNA的分布

1.制片：取口腔上皮細(xì)胞。用消毒牙簽在自己漱凈的口腔內(nèi)側(cè)壁上輕輕地刮幾下，把牙簽上附有碎屑的一端，在載玻片上旋轉(zhuǎn)地涂抹幾下。

2.染色：將甲基綠吡羅紅染色劑直接滴一滴在載玻片上，染色5min。

3.觀察：蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察。先用低倍鏡觀察，再換高倍鏡觀察，觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的顏色變化。

（二）觀察洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞DNA和RNA的分布

1.取材：用刀片在洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮上劃出一個(gè)“井”字，“井”字中央的正方形邊長(zhǎng)約為0.5cm，用鑷子將其輕輕撕下并平展在載玻片上。

2.水解：在洋蔥內(nèi)表皮上滴加兩滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的鹽酸溶液，水解5min。

3.沖洗：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3溶液沖洗材料3次，直到材料下方不會(huì)產(chǎn)生氣泡為止。然 后用吸水

紙吸干載玻片上以及材料周?chē)囊后w。

4.染色：將甲基綠吡羅紅染色劑滴一滴在載玻片上，染色5min。

5.觀察：蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察。先用低倍鏡觀察，再換高倍鏡觀察，觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的顏色變化。

（三）實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的其他問(wèn)題

1.實(shí)驗(yàn)前，染液不用當(dāng)天配置，可以保存在棕色瓶中使用一周。[4]只需在每次使用前過(guò)濾，以免視野中出現(xiàn)大量顆粒雜質(zhì)。

2.在制作人的口腔上皮細(xì)胞臨時(shí)裝片時(shí)，要盡量將口腔上皮細(xì)胞涂抹開(kāi)，防止細(xì)胞重疊。

3.以洋蔥細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，不能選擇洋蔥最外層和最內(nèi)層的幾層鱗片葉，外層的鱗片葉顏色太深，而內(nèi)層的顏色太淺，都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，所撕取的材料要盡量大一些，以邊長(zhǎng)為0.5cm的正方形為宜，撕取的材料過(guò)小會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3溶液清洗經(jīng)鹽酸水解后的洋蔥內(nèi)表皮時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氣泡，應(yīng)該盡量將氣泡驅(qū)逐干凈。但動(dòng)作要輕，避免損傷洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞。

5.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3溶液沖洗洋蔥內(nèi)表皮后，用吸水紙吸干周?chē)囊后w，以免影響染色的速度，使染色現(xiàn)象不明顯。

6.染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，染色時(shí)間太長(zhǎng)則會(huì)使細(xì)胞核顏色加深呈現(xiàn)深藍(lán)色，易與細(xì)胞質(zhì)顏色混淆。

四、實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后的優(yōu)點(diǎn)

1.節(jié)約材料：配置一瓶染料，可以保存使用一周，不用現(xiàn)配現(xiàn)用。避免了甲基綠吡羅紅染液的浪費(fèi)。

2.簡(jiǎn)化過(guò)程：觀察人的口腔上皮細(xì)胞中DNA和RNA的分布省略了烘干、水解、沖洗等步驟，簡(jiǎn)化為三個(gè)步驟，節(jié)約時(shí)間，而且觀察效果更佳。

3.精益求精：觀察洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞中DNA和RNA的分布，改成用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的鹽酸溶液水解洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細(xì)胞，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaHCO3清洗，從而使實(shí)驗(yàn)效果更加明顯。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1]申姜穎，黃慶玉，高慧英等.DNA酸解后甲基綠-派洛寧染色法的改良和應(yīng)用[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，1999，5（3）：272-273.

[2]俞如旺，林陳，康思婷.“觀察DNA和RAN在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)研究[J].生物學(xué)教學(xué)，2011，36（6）：36-38.

[3]馬曉艷.“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)及操作建議[J].生物學(xué)通報(bào)，2015，50（1）：51-52.

[4]賀俊.觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[J].實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，2014（5）：30-31.

（責(zé)任編輯 黃春香）