誘導子對海南粗榧懸浮細胞生長及三尖杉酯類堿合成的影響

龍曉娟　李永成

摘 要 為提高海南粗榧懸浮細胞三尖杉酯類堿產(chǎn)量，本實驗在懸浮培養(yǎng)第15天后，分別添加不同濃度的茉莉酸甲酯和水楊酸。通過測定細胞比生長速率、細胞活力、關鍵酶活力、產(chǎn)物合成量等，研究誘導子對海南粗榧懸浮細胞生長及三尖杉酯類堿合成的影響。結(jié)果表明：茉莉酸甲酯、水楊酸均可抑制細胞生長，增加細胞中苯丙氨酸解氨酶活力，促進酚類物質(zhì)生成，但對6-磷酸葡萄糖脫氫酶活力無顯著影響。在產(chǎn)物合成方面，100 μmol/L茉莉酸甲酯和50 μmol/L水楊酸效果最顯著，三尖杉酯類堿總量依次為10.32和7.27 mg/L，分別是對照的3.40和2.26倍。因此，在海南粗榧懸浮培養(yǎng)第15天分別添加100 μmol/L茉莉酸甲酯和50 μmol/L水楊酸最有利于三尖杉酯類堿的合成。

關鍵詞 海南粗榧；茉莉酸甲酯；水楊酸；三尖杉酯類堿；懸浮培養(yǎng)

中圖分類號 Q813.1 文獻標識碼A

Abstract In order to improve the yield of cephalotaxus alkaloids in the suspension cells of C. mannii， different doses of methyl jasmonate and salicylic acid were added to cell suspension culture of C. mannii at day 15 respectively. The effects of elicitors on the growth and cephalotaxus alkaloids accumulation of C. mannii suspension cells were studied by testing cell growth rate， cell activity， key enzyme activity， yield of cephalotaxus alkaloids et al. The results showed that both MJ（methyl jasmonate）and SA（salicylic acid）could inhibit cell growth， promot phenylalanine ammonium-lyase activity and increase the synthesis of phenols. But the two kinds of elicitors had no obvious influence on the activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase compared with the control. In terms of the accumulation of cephalotaxus alkaloids， the results indicated that cells treated with 100 μmol/L MJ and 50 μmol/L SA had the most significant effect， the content of cephalotaxus alkaloids was 10.32 mg/L and 7.27 mg/L， respectively， which was 3.40 times and 2.26 times compared with the control. Therefore with the treatmenrt of 100 μmol/L MJ and 50 μmol/L SA at day 15 in C. mannii cell suspension cultures respectively was the most effective way to enhance the yield of C. alkaloids.

Key words Cephalotaxus mannii；Methyl jasmonate；Salicylic acid；Cephalotaxus alkaloids；SDuspension culture

海南粗榧是海南特有的植物，其根、莖、葉和果實中都含有生物堿，其中主干樹皮部位含量最高。生物堿中有顯著抑瘤作用的三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿已在臨床得到廣泛應用[1-2]。隨著海南粗榧抗癌效果的發(fā)現(xiàn)，海南粗榧被大肆砍伐，再加上其生長緩慢母樹結(jié)子少，種子萌發(fā)困難，難以形成種群更新，已成為一種瀕危物種[3]。三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿在海南粗榧中的含量約為0.38%（樹皮）左右，提取一克分析純的三尖杉酯堿需要近一噸的海南粗榧木材，原料耗費巨大[4]，靠自然資源難以滿足市場需求。

細胞懸浮培養(yǎng)不受地理環(huán)境、土壤條件、季節(jié)因素限制；生產(chǎn)連續(xù)、生產(chǎn)周期短、可有目標的生產(chǎn)目的化合物，在植物藥物生產(chǎn)中應用廣泛[5-6]。誘導子是提高植物細胞培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物的有效途徑之一，在適宜條件下，利用誘導子調(diào)節(jié)植物次生代謝途徑，有利于提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[7]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MJ）作為一種重要信號分子，在影響細胞初生代謝的同時還可誘導細胞防御基因的表達[8]。水楊酸（Salicylic acid， SA）為肉桂酸衍生物，是一種廣泛存在于高等植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)，在植物許多生理過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。二者在植物細胞培養(yǎng)中應用廣泛。余龍江等[11]研究了MJ（ methyl jasmonate）對紫杉醇生物合成的影響，結(jié)果表明：培養(yǎng)20 d加入10 μmol/L MJ，紫杉醇產(chǎn)量較對照組提高280.7%。蔡長福等[12]在三尖杉細胞培養(yǎng)及其產(chǎn)物次生代謝的研究中發(fā)現(xiàn)水楊酸能有效提高三尖杉懸浮細胞生物堿產(chǎn)量。其中，2.0 mg/LSA（Salicylic acid）+8.0 mg/L赤霉素+0.5 mg/L苯甲酸鈉最有利于三尖杉酯堿合成，其產(chǎn)量為11.03 μg/g。梅興國等[13]通過研究水楊酸對紅豆杉細胞誘導作用得出：20 mg/L SA對紫杉醇合成的促進效果最明顯。Dong等[14]的研究表明適量濃度的SA（6.25～22.5 mg/L）可提高丹參細胞PAL（phenylalanine ammonium-lyaseactivity）活力，增加酚類化合物的積累，對丹參酚酸B和咖啡酸的合成有重要作用。

茉莉酸甲酯、水楊酸可激發(fā)細胞防御反應，提高苯丙氨酸解氨酶活力，促進次生代謝產(chǎn)物的合成。但以上兩種誘導子在海南粗榧中的研究尚未見報道。該研究通過測定細胞生物量、細胞活力、褐化值、苯丙氨酸解氨酶活力、6-磷酸葡萄糖脫氫酶等探討茉莉酸甲酯和水楊酸對海南粗榧懸浮細胞生長及三尖杉酯類堿合成的影響，從而達到增加三尖杉酯類堿產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗材料海南粗榧外植體采自海南省儋州市熱帶植物園，愈傷組織由本實驗室誘導獲得[15]。選取8 g質(zhì)地疏松的愈傷組織，于100 mL懸浮培養(yǎng)基，27 ℃，100 r/min黑暗繼代培養(yǎng)5代（毎代12 d），可獲得分散性良好的懸浮細胞用于實驗。懸浮培養(yǎng)基為：MS（Murashige and Skoog Basal Medium）培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+酶水解酪蛋白1 g/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5 g/L+NAA（1-naphthaleneacetic acid）4 mg/L+KT（kineten）0.1 mg/L+VB1（Vitamin B1）10 mg/L[15]。

1.2 方法

1.2.1 植物細胞培養(yǎng)與處理方法 稱6 g 1.1中懸浮細胞于80 mL上述懸浮培養(yǎng)基，于27 ℃黑暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，培養(yǎng)周期30 d。在細胞培養(yǎng)的第15天分別添加50、100、150、200 μmol/L MJ及25、50、100、150 μmol/L SA。

1.2.2 海南粗榧懸浮細胞生物量的測定 實驗中采用比生長速率衡量細胞生物量。比生長速率=細胞增長量/接種量/培養(yǎng)天數(shù)，細胞增長量=收獲量-接種量。

1.2.3 細胞活力的測定 取3 mL懸浮細胞離心去上清液，加0.6%TTC（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride）溶液3 mL，25 ℃下反應24 h，吸去TTC，用蒸餾水清洗3次，棄水溶液并收集細胞；加入3 mL 95%無水乙醇于60 ℃恒溫水浴10 min，以抽提酶反應生成的紅色甲臜，離心取上清液，冷卻，于492 nm處測定其吸光值。細胞活力單位以每克濕細胞在492 nm處的吸光值表示（OD/g）[16]。

1.2.4 培養(yǎng)液褐化的測定 取3 mL懸浮細胞離心取上清液于430 nm處測定吸光值[17]，吸光值與褐化程度成正比。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力的測定 通過測定PAL催化產(chǎn)物反式肉桂酸來測定PAL的活性[18]。取3 mL懸浮細胞離心去上清液，收集細胞。加少量聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，簡稱PVP）、石英砂、2 mL預冷的酶提取液（含5 mmol/L巰基乙醇、1%PVP、0.1 mol/L硼酸緩沖液）于冰上研磨。10 000 r/min離心15 min取上清液為酶粗提液。

1 mL酶液加1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，對照用1 mL蒸餾水代替酶液。30 ℃恒溫水浴中反應0.5 h，于290 nm處測定反應前后吸光度變化值，以反應前后每5 min吸光度變化0.01所需的酶量定義為一個單位（U）。細胞酶活性以每克濕細胞的酶單位（U/g）表示。

1.2.6 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）活力的測定

通過測定G6PDH（glucose 6-phosphate dehydro

genase）催化產(chǎn)物NADPH來測定G6PDH的活性[19]。取3 mL懸浮細胞離心去上清液，收集細胞。加少量PVP、石英砂、1 mL預冷的酶提取液（含0.42 mol/L甘露醇、0.005 mol/L KCl、0.005 mol/L MgSO4、0.05 mol/L Tris-HCl）于冰上研磨。10 000 r/min離心15 min取上清液為粗酶液。

0.1 mL酶液加0.1 mL 0.09 mol/L G-6-P-2Na、0.1 mL 0.003 mol/L NADP、0.1 mL 12.5 mmol/L MgCl2、2.6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl，35 ℃恒溫水浴中反應5 min，于340 nm處測定反應前后吸光度變化值。以反應前后每5 min吸光度的變化0.01所需的酶量定義為一個單位（U）。細胞酶活性以每克濕細胞的酶單位（U/g）表示。

1.2.7 三尖杉酯類堿含量的測定 胞內(nèi)產(chǎn)物的提?。菏斋@過濾后的懸浮細胞，60 ℃烘干，研磨為細粉，氨水潤濕細胞，甲醇浸泡，超聲破碎30 min，抽提24 h后過濾，真空濃縮至干，1 mL色譜級甲醇復溶待測。培養(yǎng)液中產(chǎn)物的提取：培養(yǎng)液用氨水調(diào)節(jié)pH 8左右，氯仿抽提3次，真空濃縮至干，1 mL色譜級甲醇復溶待測。

測定：利用HPLC（high performance liquid chromatography）法，色譜條件為：XDBC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱， 柱溫25 ℃， 0.02 mol/L乙酸銨 ∶ 甲醇=55 ∶ 45（V/V）， 流量0.8 mL/min， 檢測波長280 nm， 進樣量： 10 μL[20]。

1.2.8 統(tǒng)計分析 本實驗數(shù)據(jù)來自3個平行實驗的平均值，誤差以標準偏差表示，顯著性分析用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，Duncan法進行多重比較，p<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導子對海南粗榧懸浮細胞生長及活力的影響

通常情況下，添加誘導子會抑制細胞生長。當MJ濃度為50、100、150、200 μmol/L時，細胞比生長速率依次為0.092、0.086、0.083、0.073 d-1，對照為0.10 d-1（圖1-A）。當SA濃度為25、50、100、150 μmol/L時，細胞比生長速率依次為：0.089、0.12、0.043、0.040 d-1，對照為0.11 d-1（圖1-B）。統(tǒng)計分析表明：50、100、150、200 μmol/L 及25、100、150 μmol/L SA對細胞生長均有顯著抑制作用（p<0.05）。

圖1-C和圖1-D顯示了各實驗組在添加前（15 d）和添加后5 d內(nèi)（20 d）細胞活力的變化值。當MJ濃度為50、100、150、200 μmol/L時，細胞活力分別降低了54.51%、55.68%、58.80%、66.02%；而對照僅降低12.16%，MJ各處理均與對照差異顯著（p<0.05）（圖1-C）。在SA處理中，隨SA濃度的增加（25、50、100、150 μmol/L），細胞活力在添加SA后的5 d內(nèi)，分別降低了40.13%、38.49%、70.03% 和63.65%，對照降低了47.04%（圖1-D）。經(jīng)統(tǒng)計分析表明SA濃度大于50 μmol/L時，細胞活力降低幅度與對照差異顯著（p<0.05）。

2.2 誘導子對苯丙氨酸解氨酶活力及褐化值的影響

褐變是指細胞在培養(yǎng)過程中釋放褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基逐漸變成褐色的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體中所含酚類化合物數(shù)量有直接關系，PAL為這一途徑關鍵酶。

由圖2-A可知，添加MJ的5 d內(nèi)（20 d），隨MJ濃度的增加（50、100、150、200 μmol/L），培養(yǎng)液褐化值較添加前（15 d）分別增長了3.14、4.43、4.16及4.18倍，而對照僅增長1.75倍。然而，在添加SA的5 d內(nèi)，隨SA添加濃度的增加（25、50、100、150 μmol/L），培養(yǎng)液褐化值分別增長了1.12、1.17、1.00和1.37倍，對照增加了1.11倍（圖2-B）。由統(tǒng)計分析可知，細胞經(jīng)各濃度MJ，50 μmol/L SA及150 μmol/L SA處理后，5 d內(nèi)褐化值增量明顯高于對照（p<0.05），且MJ對褐化程度的影響要高于SA。

關于誘導子對PAL活力的影響，實驗選取了最佳濃度的MJ（100 μmol/L）、SA（50 μmol/L）與空白做比較。由圖3可知，添加MJ、SA后，PAL活力均呈先上升后下降趨勢，并在添加后的24 h達到最大值。且細胞經(jīng)MJ、SA處理后，PAL活力最大值均明顯高于對照（p<0.05）。

綜上所述，MJ、SA可激發(fā)細胞防御反應，增加PAL活力，促進酚類物質(zhì)的積累，且MJ對PAL活力及褐化程度的影響要高于SA。

2.3 誘導子對6-磷酸葡萄糖脫氫酶活力的影響

6-磷酸葡萄糖脫氫酶是磷酸戊糖途徑的關鍵酶，該途徑產(chǎn)生的4-磷酸赤蘚糖是合成三尖杉酯類堿的重要原料之一。由圖4可知，添加MJ、SA后，6-磷酸葡萄糖脫氫酶活力變化與對照無顯著差異（p>0.05），由此可見MJ、SA的作用點不是G6PDH。

2.4 茉莉酸甲酯、水楊酸對三尖杉酯類堿合成的影響

研究分別測定了三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿的含量。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，三尖杉酯類堿含量隨誘導子濃度增加而增加。統(tǒng)計分析表明：50、100、150、200 μmol/L茉莉酸甲酯和25、50、100 μmol/L 水楊酸，均可促進三尖杉酯類堿合成，且三尖杉酯類堿總量均與對照差異顯著（p<0.05）。由表1可知，100 μmol/L MJ最有利于三尖杉酯類堿的合成，其含量為10.32 mg/L，其中包含5.45 mg/L三尖杉酯類堿和4.87 mg/L高三尖杉酯類堿，三尖杉酯類堿總量是對照的3.40倍。表2表明，SA濃度為50 μmol/L時，最能促進三尖杉酯類堿合成，其含量為7.27 mg/L，其中包含4.61 mg/L三尖杉酯堿和2.66 mg/L高三尖杉酯堿，三尖杉酯類堿總量是對照的2.26倍。

3 討論與結(jié)論

誘導子作為有效促進次生代謝產(chǎn)物合成的方法之一，可激發(fā)植物形態(tài)、生理方面的反應，促進植物抗毒素的合成。此外，誘導子還可引起一系列防御反應，產(chǎn)生多種與植物防御相關的次生代謝產(chǎn)物。國內(nèi)外關于誘導子的作用機制提出過不少觀點，例如Ca2+信使影響細胞膜完整性，抑制或激活細胞內(nèi)途徑并改變胞內(nèi)滲透壓；誘導子通過影響次生代謝相關酶活性，從而調(diào)節(jié)代謝途徑，改變代謝產(chǎn)物的積累等，但關于誘導機理的描述仍不完善[21]。酚類物質(zhì)是植物防御反應中產(chǎn)生的主要次生代謝產(chǎn)物之一，PAL是合成酚類物質(zhì)的關鍵酶。有研究表明[22-23]，MJ、SA可提高植物細胞PAL活力，在本研究中，添加MJ、SA后，PAL活力和酚類物質(zhì)含量均明顯提高，說明MJ、SA激發(fā)了細胞防御反應。

培養(yǎng)液褐化程度與酚類物質(zhì)含量有密切聯(lián)系。苯丙氨酸在PAL作用下反應生成酚類物質(zhì)，此外，PAL活力的增加，也有利于次生代謝產(chǎn)物的合成[24]。研究表明，添加誘導子有利于酚類的合成（圖3、表1），但培養(yǎng)液中酚類含量并不是越多越好。當MJ濃度為200 μmol/L時，培養(yǎng)20 d時的褐化值明顯高于其他處理（圖3），但其三尖杉酯類堿含量卻不是最高的（表1）。這是因為，苯丙氨酸是酚類和三尖杉酯類堿的共同前體物，酚類物質(zhì)的過量合成不僅會消耗苯丙氨酸還會對細胞產(chǎn)生毒害作用。高濃度MJ（150、200 μmol/L），對細胞生長、細胞活力抑制作用明顯，過低的生物量和細胞活力不利于產(chǎn)物的合成。因此，要確定誘導子的最佳濃度，使其激發(fā)細胞防御反應的同時又不過分抑制細胞生長。

G6PDH是磷酸戊糖途徑的關鍵酶，對4-磷酸赤蘚糖的合成有重0要作用。4-磷酸赤蘚糖與磷酸烯醇式丙酮酸反應生成的莽草酸是合成生物堿和酚類的物質(zhì)的重要前體物[25]。有研究表明[26]，有些誘導子，如真菌誘導子可提高G6PDH活力。在本研究中，MJ、SA均沒有這種作用，說明MJ、SA的作用位點不是G6PDH。

綜上所述， 在海南粗榧懸浮培養(yǎng)第15天分別添加100 μmol/L茉莉酸甲酯和50 μmol/L水楊酸最有利于三尖杉酯類堿的合成，且100 μmol/L茉莉酸甲酯較50 μmol/L水楊酸對三尖杉酯類堿誘導效果更顯著。

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