希金斯刺盤孢全基因組候選效應(yīng)分子的預測

陳琦光等

摘 要 希金斯刺盤孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是一種世界性分布的重要植物病原真菌，可引起嚴重的十字花科植物炭疽病，影響作物品質(zhì)并造成嚴重的經(jīng)濟損失。效應(yīng)分子在植物病原真菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)已公布的希金斯刺盤孢的全基因組信息，以其全基因組蛋白序列為材料，通過生物信息學方法，對其候選效應(yīng)分子及其功能進行了預測和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor 和TargetP程序依次預測出其分泌類型的蛋白，再通過其序列大小和半胱氨酸含量作進一步篩選，最后利用blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，找出數(shù)據(jù)庫中沒有蛋白同源性的序列，從而獲得候選效應(yīng)分子；同時對希金斯刺盤孢全基因組的16 150個蛋白序列進行分析，最終預測到135個符合條件的候選效應(yīng)分子，而大多數(shù)都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息學分析方法預測出了希金斯刺盤孢的候選效應(yīng)分子，為進一步研究這些效應(yīng)分子的功能奠定了基礎(chǔ)，其研究技術(shù)和手段也為其它真菌效應(yīng)分子的預測提供了重要的參考資料。

關(guān)鍵詞 希金斯刺盤孢；效應(yīng)分子；信號肽；十字花科植物炭疽??；生物信息學

中圖分類號 S436.34 文獻標識碼 A

Abstract Colletotrichum higginsianum Sacc. is one of the important phytopathogenic fungi worldwide， and often causes severe anthracnose disease on a wide range of cruciferous plants， which influences the quality of infected crops and causes serious economic losses. The effectors of phytopathogenic fungi play an important role during the infection process of fungal pathogens on their host plants. In this study， the candidate effectors and their functions were predicted and analyzed by using bioinformatic methods based on the published full-length genome sequence of C. higginsianum and on the derived protein sequences of C. higginsianum. Firstly，all secreted proteins were predicted with SignalP， TMHMM， Protcomp， big-PI Predictor and TargetP programs. And then， a further screening through the sequence size and the cysteine content of predicted proteins was carried out. Finally， the candidate effectors were aligned with the non-redundant protein database using blastp tools， and those sequences without protein homology in the database were identified so as to obtain the candidate effectors. As a result， 135 candidate effectors of C. higginsianum were predicted by analyzing 16 150 protein sequences of C. higginsianum， and most of them are the hypothetical proteins with unknown function. Taken together， the candidate effectors of C. higginsianum were predicted by using bioinformatic methods， which lay a foundation for the further study of the functions of these effectors， and the results can also provide reference for the prediction of other fungal effectors.

Key words Colletotrichum higginsianum； Effectors； Signal peptide； Crucifer anthracnose； Bioinformatics

刺盤孢屬（Colletotrichum），俗稱炭疽菌屬，是一類世界性分布的、十分重要的植物病原真菌，其寄主范圍非常廣泛，能引起農(nóng)作物、果樹、蔬菜和林木等眾多的植物炭疽病，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害，在熱帶、亞熱帶地區(qū)尤為嚴重[1-2]。其中的希金斯刺盤孢（C. higginsianum Sacc.），俗稱十字花科炭疽菌，可引起嚴重的十字花科植物炭疽病[3]。

植物在與病原菌相互作用過程中，病原菌分泌效應(yīng)分子到寄主植物細胞中，對寄主植物細胞的生理、生化過程及細胞代謝等產(chǎn)生顯著的影響，并克服寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而促進和完成對寄主植物的侵染[4]。效應(yīng)分子一般具有以下特征[5-7]：（1）含有N-端信號肽；（2）無跨膜結(jié)構(gòu)域；（3）無糖基磷脂酰肌醇錨定位點；（4）沒有將蛋白輸送至線粒體或其它胞內(nèi)細胞器的預測定位信號；（5）氨基酸殘基數(shù)量大約在50～300氨基酸；（6）富含半胱氨酸而且特異性高。關(guān)于病原菌效應(yīng)分子的研究，目前已通過圖位克隆分離克隆得到許多植物病原效應(yīng)蛋白基因，并結(jié)合異源表達分析及結(jié)構(gòu)生物物理手段對部分效應(yīng)蛋白基因表達產(chǎn)物的功能進行了鑒定[8-10]。

迄今為止，國內(nèi)外從細胞和分子水平上研究希金斯刺盤孢對十字花科植物致病機制的有關(guān)研究報道較少。其中多數(shù)研究是以擬南芥作為寄主植物進行研究的，因為其全基因組序列已經(jīng)公布，并獲得了大量的人工突變體，而希金斯刺盤孢（C. higginsianum）具有特別的營養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，且可進行遺傳轉(zhuǎn)化[11-12]。此外，構(gòu)建由根癌農(nóng)桿菌介導的希金斯刺盤孢T-DNA插入突變體庫，通過將突變體的分生孢子接種到離體和活體的擬南芥葉片進行實驗，從而揭示了希金斯刺盤孢與擬南芥互作的分子機制[13-14]。希金斯刺盤孢-擬南芥的互作系統(tǒng)已成為病原菌與寄主植物分子互作研究的一個典型模式[15]。最近對希金斯刺盤孢的序列和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，該病原菌的大多數(shù)候選效應(yīng)分子具有種的特異性，而且通過對其侵染過程中的效應(yīng)分子分析表明，大多數(shù)的效應(yīng)分子是在其活體寄生的階段被誘導的[16-17]。因此，以十字花科蔬菜-菜心（Brassica parachinensis Bailey）[18-19]作為希金斯刺盤孢的寄主植物材料，將更有利于分析該病原菌與十字花科蔬菜之間互作的本質(zhì)及其致病的分子機制。本研究根據(jù)已公布的希金斯刺盤孢全基因組信息，通過生物信息學方法，對其中的候選效應(yīng)分子及其功能進行了初步預測和分析，以期為下一步的希金斯刺盤孢效應(yīng)分子的篩選及其功能研究并為闡明這些效應(yīng)分子在致病過程中的作用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

來自希金斯刺盤孢（C. higginsianum）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（http：//www.broad-institute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiDownloads.html）中的該病菌全基因組的16 150條蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 SignalP 4.1 Server SignalP 4.1 Server[20]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）是信號肽預測的服務(wù)器，它的功能是預測給定的氨基酸序列中是否存在潛在的信號肽剪切位點及其所在位置，原核生物和真核生物都可以進行預測。目前服務(wù)器提供的是SignalP 4.1版本。以SignalP 4.1分析獲得預測蛋白的 C、S 和 Y的最大值，以及位于N 端和被預測的剪切位點間的 S曲線的中間值，以此區(qū)分信號肽和非信號肽。而信號肽剪切位點則位于預測的含有信號肽蛋白的Y曲線的最大值處。本實驗中使用默認設(shè)置。

1.2.2 TMHMM Server v. 2.0 TMHMM Server v. 2.0[21]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）主要用于預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 ProtComp v. 9.0 ProtComp v. 9.0[22]（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompa-n&group=programs& subgroup=proloc）主要是對動物或真菌中的蛋白的亞細胞定位進行預測，它可將蛋白按以下歸屬進行劃分：細胞核、質(zhì)膜、胞外分泌、細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧物酶體、溶酶體和高爾基體。

1.2.4 Big-PI Predictor Big-PI Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）對在真菌GPI（糖基磷脂酰肌醇）修飾位點進行預測，判斷預測蛋白是否有脂質(zhì)錨定修飾。如果存在糖基磷脂酰肌醇脂質(zhì)錨定修飾，真核生物中蛋白質(zhì)需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

1.2.5 TargetP 1.1 Server TargetP 1.1 Server[23]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）用于進一步確定預測蛋白的亞細胞定位，可將蛋白的定位歸屬于線粒體、葉綠體、胞外分泌以及其它亞細胞定位。位置分配是基于任何的N-末端的前序列預測存在：葉綠體轉(zhuǎn)運肽（CTP），線粒體靶向肽（MTP）或分泌途徑的信號肽（SP）。

1.2.6 CalMolWt CalMolWt（http：//www.cnhupo.cn/CalMW/MYMW.asp）蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成的計算器。用于分析篩選出的序列的半胱氨酸含量。

1.2.7 LipoP 1.0 Server LipoP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP）用來預測脂蛋白，也用來區(qū)分脂蛋白信號肽、其他信號肽和格蘭氏陰性菌N端膜螺旋。

1.2.8 BLASTP BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch &LINK_LOC=blasthome）是使用蛋白序列到蛋白數(shù)據(jù)庫中查詢的一種工具。每條所查序列能與數(shù)據(jù)庫中已存在的每條已知序列進行序列比對，可以通過所得結(jié)果結(jié)合參數(shù)得到與此相關(guān)的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯刺盤孢效應(yīng)分子全基因組預測

在希金斯刺盤孢（C. higginsianum）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中下載全基因組序列，其中含有16 150條氨基酸序列，其基因組分析見表1。

SignalP v4.1 是用于預測原核及真核生物氨基酸序列中信號肽切割位點是否存在及其存在的具體位置，該軟件綜合了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial Neural Networks）算法和隱馬可夫模型（Hidden Markov Models）的功能[24]。根據(jù)上述的效應(yīng)分子的6個特征，使用SignalP 4.1 Server對16 150個蛋白序列進行分析，預測得到有1 528個編碼含N端信號肽的蛋白，占全基因組蛋白序列的9.46%；對所得的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，長度小于450 aa的序列最多，占了全部的77.20%（圖1）。

在含有信號肽的分泌型蛋白質(zhì)序列中，如果含有跨膜區(qū)則表明該蛋白可能為膜受體，也可能是膜上的錨定蛋白或者離子通道蛋白。本研究使用TMHMM Server v. 2.0來預測蛋白序列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，排除具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。從蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果可以看到，在含信號肽的1 528個蛋白中，有89個蛋白序列含有兩個或多個跨膜域，174個蛋白序列只含有1個跨膜域，而有1 265個蛋白序列則不含跨膜域。只含1個跨膜域的蛋白質(zhì)，其所具有的跨膜結(jié)構(gòu)域位置均位于N端，該區(qū)域可能為前期所預測的信號肽序列，而且服務(wù)器并不能完全對信號肽序列和所屬跨膜域區(qū)序列進行區(qū)分。因此，本研究選擇不含跨膜域和只含有1個跨膜域的1 439個蛋白序列進行下一步研究。

將上述初步篩選出的1 439個蛋白序列進一步用ProtComp v. 9.0進行分析，預測到共有782個信號肽分泌至胞外，17個轉(zhuǎn)運至細胞核，177個轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)膜，88個轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，207個轉(zhuǎn)運至線粒體，55個轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，19個轉(zhuǎn)運至過氧化物酶體，69個傳輸至溶酶體，20個轉(zhuǎn)運至高爾基體，5個轉(zhuǎn)運至液泡（圖2）。繼而進行GPI錨定蛋白的預測，以判斷這些被初步推斷為分泌蛋白是否為胞外蛋白。將782個分泌蛋白用big-PI Predictor 程序進行分析，發(fā)現(xiàn)有46個為GPI錨定蛋白，而736個為非GPI錨定蛋白。由于在真核細胞中，分泌蛋白的分泌目標有可能是胞內(nèi)細胞器，而非胞外。因而需要進一步用 TargetP v1.1以排除非胞外分泌蛋白。對736個非GPI錨定的分泌蛋白的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有11個含有線粒體定位信號，2個含有其它定位信號，剩下723個蛋白序列都含有胞外定位信號。

由于效應(yīng)分子的氨基酸殘基數(shù)量一般在50～300 aa之間[25-26]，因此將這723個序列按照其長度進行排列，明確了其中有457個蛋白的氨基酸殘基數(shù)量在50～300 aa之間。此外，根據(jù)效應(yīng)分子富含半胱氨酸的特點，利用CalMolWt 計算所有候選序列的半胱氨酸含量。將不含半胱氨酸的序列排除之后，得到418個半胱氨酸殘基含量在1～27數(shù)量不等的蛋白序列。最后，將上述符合條件的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，找出那些與數(shù)據(jù)庫中的沒有同源性的序列，要求其E-value值小于1e-5。最終得到135個符合上述所有6個條件的候選效應(yīng)分子，其中有30個蛋白序列在數(shù)據(jù)庫了沒有任何與之同源的序列，剩余的105個除了與刺盤孢屬（Colletotrichum）的序列有同源性外，與其他物種都沒有同源性。

2.2 希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子信號肽特征分析

現(xiàn)已明確大多數(shù)物種的信號肽主要是通過 4 種類型的信號肽酶識別位點被信號肽酶所識別并被切割，從而使成熟蛋白穿過膜轉(zhuǎn)運到細胞不同的部位[27]。本研究通過對135個候選效應(yīng)分子所含的信號肽氨基酸長度進行分析，結(jié)果顯示，含有信號肽長度為17～22 aa的蛋白質(zhì)序列數(shù)量最多，所占比例為82.22%，其中尤以所含信號肽長度為19 aa的蛋白序列居多，所占比例為18.52%（圖3）。

利用LipoP 1.0 Server對上述分泌蛋白進行信號肽酶識別位點的預測分析，結(jié)果顯示119個蛋白序列含有SpI型信號肽識別位點，14個含有CYT型信號肽識別位點以及2個含有SpII型信號肽識別位點，所占比例分別為88.15%、10.37%和1.48%，說明希金斯刺盤孢中的候選效應(yīng)分子大部分是由SpI型信號肽酶進行識別。

此外還對20種氨基酸在135個候選效應(yīng)分子信號肽中出現(xiàn)的頻率進行了分析（圖4），結(jié)果表明，在組成信號肽的氨基酸中，丙氨酸（A）的數(shù)量為579，數(shù)量最多，占21.64%；其次為亮氨酸（L），486個，占全部的18.16%；其他的依次為絲氨酸（S）、 纈氨酸（V）、 苯丙氨酸（F）、 蘇氨酸（T）、 蛋氨酸（M）、 異亮氨酸（I）、 甘氨酸（G）、 脯氨酸（P）、 精氨酸（R）、 谷氨酰胺（Q）、 賴氨酸（K）、 酪氨酸（Y）、 半胱氨酸（C）、 組氨酸（H）、 天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 色氨酸（W）和天冬氨酸（D），分別占9.34%、8.30%、7.14%、6.99%、5.49%、5.23%、2.99%、2.80%、2.50%、2.32%、1.94%、1.08%、1.05%、0.90%、0.82%、0.64%、0.45%和0.22%。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，非極性、疏水的氨基酸出現(xiàn)頻率最高（A、V、L、G、I和P），占59.12%；其次為有極性、不帶電荷的氨基酸（S、T、C、M、N和Q），占26.01%；帶負電荷的酸性氨基酸（A和E）占22.27%；帶正電荷的堿性氨基酸（K、R和H）占5.34%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占8.67%。

使用MEME[28]對希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子信號肽序列進行基序（motif）分析，發(fā)現(xiàn)存在一種氨基酸組成模式為M[KR]FSTL[LA]L[AL][LA]的基序（圖5）；對所有分泌蛋白進行基序分析發(fā)現(xiàn)，除了位于信號肽中的基序外，還存在另外2種基序，分別為P[GQ][LR][KR]E [SY][FR][CR]R和[HP][CQ][LS][RS] W [DG][LW]。

2.3 希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子的功能分析

對預測獲得的135個希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子與GenBank的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Nr和SWISS-PROT的uniprot_sprot數(shù)據(jù)庫進行比對，以獲得蛋白的參考功能信息。對比發(fā)現(xiàn)，11個效應(yīng)分子具有預測功能（表2），其余124個效應(yīng)分子皆為功能未知的假定蛋白。從表2中可以看出，大部分候選效應(yīng)分子都為有預測功能的假定蛋白，但這些所列出的功能對于維持細胞正常生命活動都具有重要作用。然而，這些功能描述的僅僅是預測的結(jié)果，它們的真實性還有待通過有關(guān)實驗作進一步的驗證。此外，大多數(shù)預測出的希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子均為功能未知的假定蛋白，也正是由于其具有特異性而形成的（正如效應(yīng)蛋白的其中一個特征所示：富含半胱氨酸而且特異性高）。

3 討論與結(jié)論

希金斯刺盤孢全基因組測序的完成和公布，為希金斯刺盤孢的分泌蛋白、致病因子和與植物之間互作的研究提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究預測得到135個符合要求的希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子，大多屬于小型蛋白，其信號肽集中在17～22 aa且含有SpI型信號肽識別位點。對于希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子功能的初步分析發(fā)現(xiàn)，預測出的92%候選效應(yīng)分子為功能未知的假定蛋白。而且，其中大概有30%的希金斯刺盤孢的蛋白與禾生刺盤孢（C. graminicola，俗稱禾谷炭疽病菌）的蛋白同源。一方面，說明了候選蛋白具有特異性，其未知功能需要進一步驗證分析；另一方面，也可以為研究禾生刺盤孢的效應(yīng)分子以及其它刺盤孢的效應(yīng)分子的共性提供一個思路。此外，目前已發(fā)現(xiàn)在卵菌和真菌中含有RxLx、LxAR（x，代表任何氨基酸）等保守基序[25，29]。本研究試圖通過對希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子的基序進行研究，但無法找到上述類似的基序。雖然目前已有不少物種開展了效應(yīng)分子的研究，但都沒發(fā)現(xiàn)類似的基序。在刺盤孢屬真菌里是否存在像卵菌一樣有規(guī)律的保守基序，還需要通過實驗研究才能夠得出相應(yīng)的結(jié)論。

本研究通過生物信息學手段，對希金斯刺盤孢候選效應(yīng)分子進行了預測。與此同時，本研究也參考了前人利用生物信息學分析軟件對粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）[30]、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）[31]、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[32]、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[33]和米曲霉（Aspergillus oryzae）[34]等進行了蛋白類型的預測，根據(jù)真菌效應(yīng)分子的特點，選擇合適合理的預測服務(wù)器和相關(guān)軟件進行分析，保證了預測結(jié)果的可靠性，但同時也可能在一定程度上漏掉一部分效應(yīng)分子，特別是那些不符合效應(yīng)分子特征但具有效應(yīng)分子功能的蛋白[17，35]。因此，需要對預測的結(jié)果進行實驗驗證。本研究已將部分候選效應(yīng)分子克隆出來，并進行了功能篩選，證明了預測結(jié)果的準確性（另文發(fā)表），為進一步研究希金斯刺盤孢效應(yīng)分子的功能打下了基礎(chǔ)。

Kleemann等[17]對希金斯刺盤孢進行了基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，得到了較多具有酶和效應(yīng)分子等功能的蛋白質(zhì)，其中從不同細胞類型和侵染階段相關(guān)的真菌轉(zhuǎn)錄組測序生成的表達序列標簽（ESTs）中得到327個候選效應(yīng)分子，但其中含有部分不含信號肽、不含半胱氨酸和沒有特異性的蛋白。而O'Connell等[16]在UniProt數(shù)據(jù)庫中，將希金斯刺盤孢測序得到的序列通過與刺盤孢屬（Colletotrichum）之外的沒有同源性的序列進行BLAST，從而得到365個候選效應(yīng)分子，其中72%的候選效應(yīng)分子是物種特異性的，與禾生刺盤孢（C. graminicola）的效應(yīng)分子缺乏同源性。而本研究沒有直接從ESTs或直接利用BLAST進行預測，而是試圖先得到分泌蛋白，再進行同源比對而得到候選效應(yīng)分子。根據(jù)真菌效應(yīng)分子的特征，通過一個規(guī)范的流程得到的候選效應(yīng)分子，更有利于對其進行共性的分析，也為其他真菌效應(yīng)分子的預測提供參考。

隨著更多的植物病原真菌全基因組序列的公布，將為進一步利用生物信息學手段和方法對這些病原真菌的效應(yīng)分子進行分析提供了條件。如禾生刺盤孢（C. graminicola）已最終預測明確286個具有典型特征的效應(yīng)分子[36]，而楊生褐盤二孢菌（Marsonina brunnea）最終預測得到106個候選效應(yīng)因子[26]，稻瘟病菌（M. oryzae）通過候選基因進行表達分析和同源比對最終發(fā)現(xiàn)有42個符合條件的分泌蛋白基因[37]等。同時，基因組測序加快了功能基因的研究速度，可以根據(jù)某個基因的序列來推測其相應(yīng)功能進而進行功能驗證，這樣就可以批量地研究生物基因的功能。當獲得了預測得到的候選效應(yīng)分子后，需通過原核表達及PCD（programmed cell death，細胞程序性死亡）檢測才可以驗證候選效應(yīng)分子是否為效應(yīng)分子，從而更好地研究其功能及其與寄主植物之間的相互作用。

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