水稻4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期莖部可培養(yǎng)內(nèi)生菌多樣性分析

王雪君等

摘 要 為了解水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)生細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化及其多樣性，以水稻品種明恢63（MH63）為研究對(duì)象，種植于海南省三亞市連作水稻試驗(yàn)田中，分別于水稻幼苗期、分蘗期、開(kāi)花期和結(jié)實(shí)期（2014年1月到4月份）分離莖部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌。結(jié)果表明：共獲得了細(xì)菌域4個(gè)門(mén)6個(gè)綱51個(gè)屬99個(gè)種共計(jì)529株分離菌株，其中幼苗期分離到23個(gè)屬33個(gè)種，分蘗期分離到30個(gè)屬44個(gè)種，開(kāi)花期分離到15個(gè)屬20個(gè)種，結(jié)實(shí)期分離到20個(gè)屬29個(gè)種。上述4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期均分離到伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、草螺菌屬（Herbaspirillum）和黃桿菌屬（Flavobacterium），且以伯克霍爾德氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。多樣性指數(shù)排序：分蘗期>幼苗期>結(jié)實(shí)期>開(kāi)花期；優(yōu)勢(shì)度指數(shù)排序：開(kāi)花期>結(jié)實(shí)期>幼苗期>分蘗期。水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌具有較豐富的遺傳多樣性，不同生長(zhǎng)期的種群數(shù)量、優(yōu)勢(shì)度存在差異，開(kāi)花期優(yōu)勢(shì)菌群集中，優(yōu)勢(shì)屬突出，優(yōu)勢(shì)度較高；而分蘗期優(yōu)勢(shì)度較低，但種群種類(lèi)較豐富，且分布均勻。

關(guān)鍵詞 水稻；內(nèi)生細(xì)菌；不同時(shí)期；多樣性

中圖分類(lèi)號(hào) S511；Q939.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To understand the biodiversity and distribution of endobacteria in rice though the whole grow stages， we isolated and identified the endobacteria from rice cultivar Minghui 63（MH63）crossing the whole growth stages including seedling stage， tillering stage， flowering stage and productive stage. The rice endobacteria（529 isolates in total）belong to 4 phylums， 6 classes， 51 genus， and 99 species. Among them， 33 species （23 genus） were isolated from rice seedling stage； 44 species （30 genus） were isolated from rice tillering stage；20 species（15 genus）were isolated from rice flowering stage； and 29 species （20 genus） were isolated from rice productive stage. The dominated class is Burkholderia， leading Herbaspirillum and Flavobacterium which consistently present in all growth stages. Shannon-Wiener index（H′）revealed that H′tillering>H′seedling>H′productive>H′flowering. Simpson index（D） revealed that Dflowering>Dproductive>Dseedling>Dtillering. Our study inferred that the rice endobacteria were diversity， the Shannon-Wiener index and Simpson index was difference between the growth stages. Additionally， we found that the most diversified endobacteria presented in tillering stage， which suggested the interaction between endobacteria and plant might more activate. Less diversity was found in flowering stage indicated that flowering stage have more dominant species.

Key words Rice（Oryza sativa）；Endobacteria；Four growth stages；Diversity

植物內(nèi)生細(xì)菌生活在宿主體內(nèi)的特殊環(huán)境中，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生態(tài)功能產(chǎn)生重要影響[1]，包括為宿主植物提供激素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]、植物殘骸的生物降解[3]、植物重金屬污染的修復(fù)[4]及植物芳香族化合物的降解[5]，也可作為生物防治菌抵抗病菌[6]和蟲(chóng)害[7]，或作為生物肥料增加產(chǎn)量[8]，以及提高宿主植物的抗逆性[9]等。內(nèi)生菌多樣性的研究對(duì)探索植物-微生物互作機(jī)制、反應(yīng)宿主植物生長(zhǎng)情況、提高宿主抗病和抗逆境的能力、開(kāi)發(fā)可作為生物肥料及具有生防載體菌的生物資源等具有重要意義。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，目前水稻產(chǎn)量的提高主要靠大面積施用化肥和農(nóng)藥，對(duì)環(huán)境造成極大的污染。而微生物肥料具有無(wú)毒、無(wú)污染、作用時(shí)間長(zhǎng)、成本低等特點(diǎn)，可以彌補(bǔ)化學(xué)肥料和農(nóng)藥的缺點(diǎn)。近幾年植物內(nèi)生菌逐步作為生物肥料及生防載體菌被加以利用[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外研究工作主要集中于不同品種水稻內(nèi)生菌與品系之間的關(guān)系研究[10]，以及內(nèi)生菌與宿主植物或根際土壤微生物的相互作用[11]，而關(guān)于水稻不同生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)生菌群落多樣性的研究以及內(nèi)生菌對(duì)不同時(shí)期水稻生長(zhǎng)發(fā)育的作用和影響報(bào)道甚少。黎起秦等[12]對(duì)廣西水稻苗期、分蘗期、孕穗期、灌漿期和乳熟期的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，但分離到的菌種數(shù)量較少。本研究通過(guò)分離水稻4個(gè)主要生長(zhǎng)時(shí)期的莖組織內(nèi)生細(xì)菌來(lái)揭示內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，以期掌握水稻內(nèi)生菌資源情況及了解內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)與水稻生長(zhǎng)時(shí)期的關(guān)系，為深入探討內(nèi)生菌與水稻間的相互作用機(jī)制和發(fā)掘植物益生內(nèi)生菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為明恢63（MH63），種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。于2013年12月24日播種，常規(guī)水育秧，3葉期移栽。試驗(yàn)田位于海南省三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院內(nèi)，土壤質(zhì)地為沙性土，中等肥力，前作水稻。水稻生長(zhǎng)期間按常規(guī)進(jìn)行水肥和病蟲(chóng)害管理。于2014年1月、2月、3月、4月中下旬分別采集水稻幼苗期、分蘗期、開(kāi)花期和結(jié)實(shí)期的水稻植株。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 使用對(duì)角線五點(diǎn)采樣法采集樣品，每點(diǎn)采樣3株，每小區(qū)采15株，將水稻連根帶土挖出，并在48 h內(nèi)將樣品處理完畢。

1.2.2 水稻莖組織內(nèi)生菌分離 采用表面消毒研磨法分離水稻內(nèi)生菌[13]。（1）稱(chēng)取水稻莖部組織5 g，置于20%的次氯酸鈉溶液（加入2滴吐溫20）中浸泡10 min，再用無(wú)菌水漂洗3次，并將最后一次漂洗過(guò)的無(wú)菌水涂布平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)則證明植物材料表面已消毒完全；（2）將漂洗好的樣品移入無(wú)菌研缽中，用滅菌的剪刀將材料剪碎，加入20 mL無(wú)菌水，充分研磨10 min，再分別取200 μL研磨液和10倍稀釋溶液涂平板；（3）將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，再?gòu)膭澗€培養(yǎng)的平板上挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，振蕩搖床的培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)28～36 h，將菌液分裝備份，部分菌體用于DNA提取，部分菌體用于低溫保存。

1.2.3 內(nèi)生菌培養(yǎng)基 YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.25 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.1g，CaCO3 0.1g，酵母粉3.0 g，瓊脂15 g，加水至1 L，pH7.0～7.2；BPA肉汁胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，蔗糖10 g，加水至1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.4 菌種的保存 吸取0.5 mL菌液及等體積40%的甘油于離心管中，制成20%的菌種，于-80 ℃保存。

1.2.5 DNA提取 將供試菌株活化后接種到液體培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期，離心收集菌體于2 mL離心管中。采用硅藻土-堿性裂解提取法[14]提取內(nèi)生細(xì)菌DNA。

1.2.6 16S rDNA擴(kuò)增 以提取的內(nèi)生菌DNA為模板擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′），反向引物1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[15]。50 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板（10 ng/μL）1μL，引物（10 pmol/μL）各1 μL，2×Go Taq Green Master Mix（Promega）25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1.4 min， 共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 水稻內(nèi)生菌的鑒定 將測(cè)序得到的結(jié)果拼接后，分別登陸NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Ezbiocloud（http：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行序列比對(duì)，確定其與已知序列的同源關(guān)系，序列相似性達(dá)到98%以上的歸為同一個(gè)種。

1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)計(jì)算[16] Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）計(jì)算公式如下：

H′=-Σ[Ni/Nln（Ni/N）]

式中：Ni為第i個(gè)種的個(gè)體數(shù)目，N為群落中所有種的個(gè)體總數(shù)。群落中生物種類(lèi)越多代表群落的復(fù)雜程度增高，即H′值愈大，多樣性越高，群落所含的信息量愈豐富。

D=1-ΣPi2

其中：Pi=Ni/N。D值越大，表示優(yōu)勢(shì)物種越少，亦表示奇異度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定結(jié)果

通過(guò)平板培養(yǎng)的方法從不同時(shí)期水稻莖內(nèi)共分離到內(nèi)生細(xì)菌529株，以27F、1492R為引物進(jìn)行16SrDNA片段擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約1 400 bp的擴(kuò)增片段。將測(cè)序所得到的序列拼接后在Ezbiocloud中進(jìn)行比對(duì)，相似度大于98%以上的歸為同一個(gè)種。結(jié)果表明（表1），水稻品種明恢63莖部?jī)?nèi)生菌涉及細(xì)菌域的4個(gè)門(mén)、6個(gè)綱、51個(gè)屬，共99個(gè)種。包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）α-變形菌綱（Alphapro

teobacteria）的14個(gè)屬、 β-變形菌綱（Betaproteobacteria）的10個(gè)屬、 γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的9個(gè)屬、 厚壁菌門(mén)（Firmicutes）桿菌綱（Bacilli）的7個(gè)屬、 擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）擬桿菌綱（Bacteroidetes）的4個(gè)屬以及放線菌門(mén)（Actinobacteria）放線菌綱（Actinobacteria）的7個(gè)屬， 主要包括伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的8個(gè)不同種； 其次，芽孢桿菌屬（Bacillus）和根瘤菌屬（Rhizobium）各含有6個(gè)不同種；無(wú)色菌屬（Achromobacter）和新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）各含有5個(gè)不同種。

2.2 水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌在各個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)情況

水稻莖組織內(nèi)生細(xì)菌在不同時(shí)期的生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。水稻幼苗期、分蘗期、開(kāi)花期、結(jié)實(shí)期分離到的莖組織內(nèi)生細(xì)菌分別為23個(gè)屬33個(gè)種、30個(gè)屬44個(gè)種、15個(gè)屬20個(gè)種、20個(gè)屬29個(gè)種。其中分蘗期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌種類(lèi)最多，開(kāi)花期內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)最少，且不含厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）。分離所得的水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌中，Burkholderia gladioli在幼苗期和開(kāi)花期豐富度均最高，分別占17.35%和20%；Burkholderia vietnamiensis在分蘗期豐富度最高，占11.96%；Burkholderia seminalis在結(jié)實(shí)期豐富度最高，占16.67%。

在水稻的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中，伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、草螺菌屬（Herbaspirillum）和黃桿菌屬（Flavobacterium）均有發(fā)現(xiàn)。在水稻幼苗期、分蘗期和開(kāi)花期，伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）為主要優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度分別為17.34%，13.04%，40.00%；在水稻結(jié)實(shí)期，優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），相對(duì)豐度分別為20.99%和20.37%。

水稻4個(gè)時(shí)期均含有特異的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)。Kaistia、Devosia、Roseateles、Dyadobacter、Stenotro-

phomonas僅分離于水稻幼苗期；Ensifer、Ancylobacter、Cupriavidus、Ideonella、Pelomonas、Enterobacter、Cohnella、Novosphingobium、Promicromonospora、Met-

hylobacterium、Leucobacter僅分離于水稻分蘗期；Xenophilus、Dyella、Kosakonia僅分離于水稻開(kāi)花期；Labrys、Shinella、Acidovorax、Paenibacillus、Rummeliibacillus、Pseudoxanthomonas、Xanthomonas、Sphingobacterium僅分離于水稻結(jié)實(shí)期。

2.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性分析

植物內(nèi)生菌的生物多樣性是衡量其內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定和健康的一個(gè)重要指標(biāo)，適宜的植物內(nèi)環(huán)境，其內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富，優(yōu)勢(shì)度低，細(xì)菌種類(lèi)分布均勻。通過(guò)計(jì)算得到水稻4個(gè)時(shí)期莖組織內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)。結(jié)果表明（圖1），4個(gè)時(shí)期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的Shannon-Wienner多樣性指數(shù)和 Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為：幼苗期（3.13，0.053）、分蘗期（3.49，0.035）、開(kāi)花期（2.62，0.087）、結(jié)實(shí)期（2.80，0.081）。Shannon-Wienner多樣性指數(shù)排序：分蘗期>幼苗期>結(jié)實(shí)期>開(kāi)花期；Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)排序：開(kāi)花期>結(jié)實(shí)期>幼苗期>分蘗期。水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌具有較豐富的遺傳多樣性，不同生長(zhǎng)期莖組織內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性、優(yōu)勢(shì)度存在差異。分蘗期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)度較低，但種群種類(lèi)較豐富，且分布均勻；開(kāi)花期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群集中，優(yōu)勢(shì)屬突出，存在單一物種Burkholderia gladioli（相對(duì)豐度高達(dá)20%），造成開(kāi)花期水稻莖組織內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)度最大。

3 討論與結(jié)論

為了得到能夠用于純培養(yǎng)并能進(jìn)一步研究、應(yīng)用的植物內(nèi)生細(xì)菌，本研究采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對(duì)水稻4個(gè)不同生長(zhǎng)期莖組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化及鑒定。目前報(bào)道的水稻內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)33個(gè)屬64個(gè)種，主要包括Bacillus、Enterobacteriaceae、

Methylobacterium、Pantoea、Pseudomonas及其相近屬。本研究分離出了種類(lèi)更加豐富的水稻內(nèi)生細(xì)菌。其中，水稻幼苗期、分蘗期、開(kāi)花期優(yōu)勢(shì)菌為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），且種數(shù)和豐富度均最高；而結(jié)實(shí)期優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），這與劉云霞等[17]和胡桂萍等[10]報(bào)道的從水稻中分離到的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌屬的結(jié)果相同。

本研究發(fā)現(xiàn)，在水稻的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，水稻莖部中都存在黃桿菌（Flavobacterium）、草螺菌（Herbaspirillum）和伯克霍爾德氏菌（Burkholderia），它們?cè)谒九c環(huán)境的互作過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。王銀善等[18]從農(nóng)藥污染嚴(yán)重的棉田土中分離到一株對(duì)硫磷降解能力較強(qiáng)的黃桿菌P3-2，該菌還可降解殺螟松、甲基對(duì)硫磷和水胺硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥。王以斌等[19]發(fā)現(xiàn)，黃桿菌能夠產(chǎn)生紅色抑藻活性物質(zhì)（靈菌紅素），可有效抑制塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。草螺菌作為植物體內(nèi)的微需氧固氮菌，是一類(lèi)嗜用有機(jī)酸、耐性強(qiáng)、可在高糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并固氮的微生物。伯克霍爾德氏菌是一類(lèi)能夠利用自身固氮的微生物，在水稻4個(gè)生育期中最有優(yōu)勢(shì)。李紀(jì)順等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥上分離得到的一株伯克霍爾德氏菌具有固氮和解磷活性，能促進(jìn)小麥根的生長(zhǎng)，且對(duì)小麥紋枯病、小麥全蝕病和番茄南方根結(jié)線蟲(chóng)病等都具有良好防治效果。

植物不同生長(zhǎng)時(shí)期的內(nèi)環(huán)境有所不同，會(huì)影響植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的變化。水稻莖組織內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)豐富度在宿主植物中的變化規(guī)律是：從幼苗期到分蘗期上升，開(kāi)花期下降，結(jié)實(shí)期豐富度又有所上升。黎起秦等[12]研究發(fā)現(xiàn)，廣西水稻內(nèi)生菌數(shù)量從苗期到分蘗期上升，于孕穗期達(dá)到最高，從灌漿期到乳熟期數(shù)量下降。這與本研究結(jié)果（開(kāi)花期水稻莖部?jī)?nèi)生菌豐富度相對(duì)較低，結(jié)實(shí)期水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌又有所增加）不太一致，這可能是由于植物內(nèi)生菌主要來(lái)自土壤、空氣、種子，與植物品種、栽培環(huán)境、氣候條件等有著直接的關(guān)系。

本研究得到的內(nèi)生細(xì)菌中有大量的有益微生物，可用于開(kāi)發(fā)生物肥料，或作為生物防治菌和環(huán)境污染修復(fù)菌。這些益生菌如何有效應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍有待深入研究。同時(shí)，在今后的研究中，還需進(jìn)一步揭示這些內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主稻株的影響和作用，以及內(nèi)生菌群落的變化與水稻生長(zhǎng)之間的關(guān)系等。這些問(wèn)題的明確對(duì)今后水稻栽培和生物防治具有積極的意義。

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