割手密過氧化物酶基因SsPOD—1cDNA克隆與功能分析

胡小文　姚艷麗　邢淑蓮　徐磊　劉洋

摘 要 割手密（Saccharum spontaneum）屬于甘蔗屬細莖野生種，具有較強的抗逆性，是甘蔗育種的優(yōu)良材料。過氧化物酶（POD）是活性氧系統(tǒng)（ROS）中的一個關鍵酶，是植物應對干旱脅迫的關鍵調(diào)控酶之一。利用同源克隆的方法，以割手密為材料，成功克隆2個POD等位基因序列（SsPOD-1a和SsPOD-1b，GenBank登錄號為KJ002565和KJ002566）。經(jīng)測序鑒定，這2個基因長度均為1 083 bp，其中包括27 bp的5′非編碼區(qū)、60 bp的3′非編碼區(qū)及一個996 bp的開放閱讀框，共編碼331個氨基酸，這2個等位基因的序列相似性為98.8%。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，此2個基因均具有POD基因典型保守結(jié)構(gòu)域，屬于依賴于亞鐵血紅素Ⅲ型POD亞類。原核表達結(jié)果表明，這2個基因編碼區(qū)能正常表達出目的蛋白，說明得到的這2個基因為功能基因，而不是假基因。POD基因分子系統(tǒng)分生分析結(jié)果表明，割手密POD基因與高粱、玉米、水稻等禾本科植物親緣關系較近，與一些雙子葉植物及裸子植物也有一定的親緣關系，這也證實了POD基因起源較為古老且存在高度保守區(qū)。

關鍵詞 割手密；POD；基因克隆；抗旱

中圖分類號 S566.1 文獻標識碼 A

Abstract Saccharum spontaneum L. is a wild variety of sugarcane with tolerance to drought-stress and can be used in sugarcane breeding programs. Gene encoding peroxidases respond to stress-related signals and are believed to play key roles in these processes. In this study， two novel peroxidase（POD） allele genes（SsPOD-1a and SsPOD-1b） were cloned by using the homologous cloning strategy. Sequencing data showed both of the two cloned genes had 1 083 base pair， including 5′ untranslated regions 27 bp， 3′ untranslated regions 60 bp， and a 996 bp ORF， which coding 331 amino acid， and the similarity of the two allele gene is 98.8%. The structural domain of proteins analysis showed the two genic protein had typical well-conserved amino-acid residues about peroxidases， and were classified to heme containing class Ⅲ peroxidases. The protein expression experiment revealed that both of gene coding areas could express aim protein， indicating SsPOD-1a and SsPOD-1b were not pseudogene， but function genes. The phylogeny analysis indicated that peroxidase genes of S. spontaneum L. were similar to the grass family， including Sorghum bicolor， Zea maize and Oryza sativa， also had relationship to the dicotyledon plants， even to some gymnosperms， vertifying the origin of peroxidase genes are old and exist well-conserved region.

Key words Saccharum spontaneum L.；Peroxidases；Gene clone；Drought resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.017

割手密（Saccharum spontaneum）屬于復雜多倍體甘蔗屬細莖野生種，現(xiàn)大多數(shù)甘蔗栽培種是割手密與熱帶甘蔗栽培種的雜交后代。割手密分布范圍廣、類型多、分蘗多、宿根性好、抗逆性強等優(yōu)良性狀，是甘蔗改良育種的優(yōu)良材料[1]。植物在受干旱脅迫時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，而活性氧的大量積累會嚴重威脅植物的生存[2]。過氧化物酶（POD）以H2O2為電子受體催化底物氧化，是植物體內(nèi)有效清除活性氧的關鍵酶之一，對植物應對逆境脅迫有非常重要的作用[3]。植物中POD的結(jié)構(gòu)和反應機理已研究的較為清楚[4-5]，擬南芥、水稻、小麥、棉花等植物POD基因的研究也均有報道[6-9]，但抗旱能力非常強的割手密其POD基因相關研究還未曾報道，割手密POD基因的研究有助于闡明高抗旱植物水分代謝調(diào)控機理。因此，本研究以與割手密親緣關系較近的高粱POD基因序列為探針，利用同源克隆技術(shù)克隆獲得割手密POD基因，通過對其基因結(jié)構(gòu)及遺傳關系的比較分析，旨在基因水平上對POD基因在植物抗旱性方面有一些新的認識，從而為進一步通過生物技術(shù)改良甘蔗品種的抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料采集 本試驗所采用的割手密來源于云南國家甘蔗種質(zhì)資源圃割手密82-114，在廣東湛江進行盆栽試種，出苗2個月后，取頂端第2片葉于液氮中速凍，提取總RNA。

1.1.2 主要試劑 RNA提取采用北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyPure Plant RNA Kit試劑盒，反轉(zhuǎn)錄采用Thermo Scientific公司的 Thermo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase試劑盒，DNA聚合酶采用大連寶生物公司的Master Mix Taq（已包含Loading Bufer和dNTPs），DNA純化采用天根生化科技有限公司的“普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒”，基因克隆轉(zhuǎn)化采用北京全式金公司的pEASY-T5 Zero Cloning Kit?；虻鞍椎脑吮磉_采用北京全式金公司的pEASY-E1 Expression Kit試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按照EasyPure PlantRNA kit試劑盒提供的方法提取割手密葉片的RNA。

1.2.2 cDNA的合成 利用Thermo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase試劑盒對獲得的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得到割手密的cDNA。

1.2.3 割手密POD基因cDNA參考序列的推導 以與割手密親緣關系較近的高粱POD基因cDNA序列為探針，在NCBI中檢索甘蔗屬（Saccharum officinarum complex）EST數(shù)據(jù)庫，獲得覆蓋編碼區(qū)的相似性最高的EST序列，再將這些EST序列進行拼接，去除重復區(qū)，獲得假定的割手密POD基因的cDNA序列。

1.2.4 引物設計與PCR擴增 為提高PCR擴增的產(chǎn)量和特異性，采用巢式PCR，以假定的割手密POD基因的cDNA序列為模板，設計2對引物對目標區(qū)域進行2輪PCR擴增。2輪PCR程序均采用：94 ℃預熱5 min；然后94 ℃預熱30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s ，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將目的PCR產(chǎn)物利用“普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒”進行純化。

1.2.5 基因克隆與檢測 將純化的目的PCR產(chǎn)物按照“pEASY-T5 Zero Cloning Kit”試劑盒的方法轉(zhuǎn)入克隆載體，利用感受態(tài)細胞對克隆進行轉(zhuǎn)化，PCR擴增鑒定陽性重組子，挑選2個陽性克隆送到英駿（廣州）生物技術(shù)公司測序部進行測序，獲得割手密POD基因的cDNA序列。最后對獲得的序列進行基因結(jié)構(gòu)功能分析與預測。

1.2.6 SsPOD-1a和SsPOD-1b基因的原核表達 將克隆得到的SsPOD-1a和SsPOD-1b基因利用PCR得到其蛋白表達區(qū)（ORF），按照pEASY-E1 Expression Kit試劑盒的方法步驟構(gòu)建原核表達載體，將得到的表達載體轉(zhuǎn)入BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細胞，接入新鮮LB液體培養(yǎng)基37 ℃，200 r/min培養(yǎng)到OD600為0.5后加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導目的基因表達。到達一定時間后，取1 mL菌液，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入100 μL的ddH2O重懸，并加入等體積的2X SDS凝膠上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl pH6.8，20%甘油，0.2%溴酚藍，4%SDS，2%DDT），沸水加熱10 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE。電泳緩沖液為TGE，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳電壓為120 V。電泳完成后用考馬斯這藍R-250（質(zhì)量濃度為0.1%）染色1 h。染色完成后采用脫色液進行脫色（冰乙酸 ∶ 甲醇 ∶ H2O=1 ∶ 3 ∶ 6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得割手密POD基因cDNA參考序列

以高粱POD基因cDNA序列（XM_002437414.1）為探針，采用1.2.3介紹的方法，提取3條與XM_002437414.1相似性較高且覆蓋編碼區(qū)的EST序列（表1和圖1），對這3條EST序列進行拼接去除重復區(qū)后，獲得1 409 bp的割手密POD基因的cDNA參考序列。

2.2 引物設計與PCR擴增

按照上述引物設計的方法，設計的2對引物情況見表2（其中擴增區(qū)域大小與位置以拼接的割手密POD基因的cDNA參考序列計算），預計最終PCR產(chǎn)物長度為1 084 bp。將割手密POD基因的cDNA以此2對引物經(jīng)2輪PCR后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，PCR擴增產(chǎn)物大小約為1 000 bp，與預測的結(jié)果一致，可認定為目的條帶。

2.3 目的序列的確定和結(jié)構(gòu)分析

測序獲得的2個序列長度均為1 083 bp，比預測的目的片段少1個堿基，經(jīng)過比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺少的這個堿基出現(xiàn)在3′非編碼區(qū)（第1 024個堿基），未影響其開放閱讀框，且這2個序列編碼區(qū)均能翻譯成氨基酸序列，可認為此2個克隆均為目的基因克隆。將此2條序列命名為SsPOD-1a和SsPOD-1b，并將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號KJ002565、KJ002566。

測序獲得的序列與參考序列比較，共有27個差異位點（圖3），涉及到13個氨基酸差異，其中SsPOD-1a和SsPOD-1b之間有7個差異位點（表3），有4個氨基酸差異位點。

2.4 蛋白功能預測

SsPOD-1a和SsPOD-1b基因的序列全長為1 083 bp，其中開放閱讀框長度為996 bp，5′非翻譯區(qū)27 bp，3′非翻譯區(qū)60 bp。這2個基因均編碼331個氨基酸，序列相似性為98.8%。利用Expasy中的protparam對SsPOD-1a和SsPOD-1b的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行預測，蛋白分子量大小分別為35.84、35.82 ku，等電點pI均為8.59，屬于堿性蛋白，GRAVY值（Grand average of hydropathicity）均為0.044，為疏水蛋白，不穩(wěn)定（穩(wěn)定系數(shù)分別為40.08、39.70）。利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/docs/cdd_search.html）進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，此蛋白屬于依賴于亞鐵血紅素Ⅲ型POD亞類，此類POD主要出現(xiàn)在細胞間質(zhì)和液泡中，主要與過氧化氫分解、生長素代謝、木質(zhì)素合成和抗逆反應有關[10]，包含4個保守的二硫鍵和2個保守的鈣結(jié)合位點（圖4）。

2.5 SsPOD-1a和SsPOD-1b在BL21感受態(tài)細胞中的表達

按照上述方法將SsPOD-1a和SsPOD-1b轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細胞，分別誘導表達0、1、2、4 h后的表達情況見圖5。由圖5可以看出，在剛開始誘導時（第2和第6泳道），目的蛋白（35.8 ku）幾乎沒有表達，但在誘導1、2、4 h后（第3，4，5泳道和第7，8，9泳道），目的蛋白均有表達。說明克隆得到的SsPOD-1a和SsPOD-1b的表達區(qū)域能正常表達出蛋白。

2.6 POD基因蛋白進化分析

將SsPOD-1a和SsPOD-1b的氨基酸序列在NCBI做blastp，找到其它物種的POD氨基酸序列，并利用MEGA6.06軟件，采用Neighbor-joining法做系統(tǒng)發(fā)育分析（圖6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆得到的割手密POD基因與高粱的POD基因的親緣關系最近，其次為禾本科植物的玉米和水稻，與一些雙子葉植物及裸子植物也有一定的親緣關系，且親緣關系的遠近與植物分化的程度相關性很大，說明POD基因起源較為古老且較為保守，可為植物分類作參考。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代基因克隆技術(shù)主要有同源克隆、功能克隆和圖位克隆等，各種基因克隆方法均有各自的優(yōu)勢和不足[11]，結(jié)合本試驗的實際情況，采取同源克隆方法比較準確和方便。傳統(tǒng)同源克隆一般是找到親緣關系較近的物種基因結(jié)構(gòu)和功能比較清楚的同源基因序列，利用基因保守性，在同源區(qū)域設計引物，克隆得到基因。但此種方法有一定的局限性，如果在進行引物設計時，引物區(qū)與實際序列存在差異，就很難擴增到目的片段，為盡量避免這種情況的出現(xiàn)，本研究做了一些改進，在得到割手密親緣關系較近的高粱POD基因序列（XM_002437414.1）后，將此序列和割手密關系更近的甘蔗EST庫進行blast比對，找到相似度更高的EST拼接成一條假設的割手密POD基因的cDNA序列，根據(jù)此cDNA序列設計引物，擴增POD基因，為進一步提高擴增效率和特異性，采用巢式PCR，設計2對引物，成功獲得目的基因。但巢式PCR也有一定的不足，即第二輪擴增丟失了一段5′UTR和3′URT區(qū)域，但對重點研究表達區(qū)域的基因來說，并不影響其表達序列的分析。

包含亞鐵血紅素的POD根據(jù)來源可分為2個亞族，來源于哺乳動物的為一類，來源于細菌、真菌和植物的為另一類，而第二種POD又可分為3類，一種是與細菌POD類似的Ⅰ型，一種是存在于真菌細胞外的Ⅱ型，還有一種是與植物分泌途徑相關的Ⅲ型，這也是研究得最為廣泛的一種類型[12]，根據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)域結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，本試驗克隆得到的割手密POD基因也屬于此類。在植物POD亞族中，構(gòu)成POD基因的原始序列在個體中是高度可變的，整個氨基酸序列在不同植物種類中相似性有時會少于35%，然而90%參與催化的殘基在不同植物中均存在[6]，這表明對于不同植物個體，雖然POD基因編碼序列存在較大差異，但功能區(qū)相對保守，而序列的差異也導致了POD在應對環(huán)境刺激時的差異。Hiraga等[7]利用基因特異探針研究了21個水稻POD基因在環(huán)境脅迫時基因的表達情況，結(jié)果表明它們在面對相同或不同環(huán)境脅迫時均存在顯著差異。郭媖等[13]從陸地棉中克隆得到2個相似性達99%的POD基因，通過RT-PCR研究結(jié)果表明，這2個基因在植株不同部位、不同生長階段的表達情況均有所不同。這表明POD在植物體內(nèi)存在很多同工酶，且這些酶在植物不同部位、不同時間或不同環(huán)境的分布均有所不同，很難確定單一的POD在面對環(huán)境刺激所起的作用。從本研究克隆得到的割手密POD基因的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，不同物種POD基因的氨基酸組成之間存在較大差異，且差異隨著親緣關系的遠近而變化，依此推斷，同屬于甘蔗屬的割手密與栽培甘蔗的POD基因差異應較小。POD是應對干旱脅迫的關鍵調(diào)控酶之一[3]。割手密和栽培甘蔗的POD基因的氨基酸組成差異應不是很大，而割手密耐旱性卻遠高于栽培甘蔗，這說明植物應對干旱脅迫是一個復雜的過程，有多個基因參與應對環(huán)境脅迫，單一的POD基因并不能決定植物的耐旱性，所以需要研究更多的割手密和栽培甘蔗的POD基因才能找到響應干旱脅迫的關鍵基因，才能進一步闡明POD基因在應對干旱脅迫時所起的作用，為研究植物應對干旱逆境時基因調(diào)控機制奠定基礎，以解釋各植物耐旱性差異的根本原因。

致謝 感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所給予的經(jīng)費支持，感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院湛江實驗站提供本實驗所需的科研條件，感謝在本研究中給予幫助和關心的各位老師和工作人員！

參考文獻

[1] 陳 輝，范源洪，史憲偉，等. 甘蔗細莖野生種（Saccarun spontaneum L.）的遺傳多樣性和系統(tǒng)演化研究[J]. 作物學報，2001， 27（5）： 645-652.

[2] 張木清， 陳如凱. 作物抗旱分子生理與遺傳改良[M]. 北京： 科學出版社， 2005.

[3] 梁艷榮， 胡曉紅， 張潁力，等. 植物過氧化物酶生理功能研究進展[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報， 2003， 24（2）： 110-113.

[4] Schuller D J， Ban N， Huystee R B， et al. The crystal structure of peanut peroxidase[J]. Structure， 1996， 4（2）： 311-321.

[5] Berglund G I， Carlsson G H， Smith A T， et al. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution[J]. Nature，2002， 417（3）： 463-468.

[6] Kjaersgard I V， Jespersen H M， Rasmussen S K， et al. Sequence and RT-PCR expression analysis of two peroxidases from Arabidopsis thaliana belonging to a novel evolutionary branch of plant peroxidases[J]. Plant Molecular Biology， 1997， 33（4）： 699-708.

[7] Hiraga S， Yamamoto K， Ito H， et al. Diverse expression profiles of 21 rice peroxidase genes[J]. FEBS Lett， 2000， 471： 245-250.

[8] 單麗偉， 羅海霞， 范三紅， 等. 小麥種子過氧化物酶基因wp1的克隆及在大腸桿菌中的表達[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）， 2009， 37（3）： 213-218.

[9] Delannoy E， Marmey P， Jalloul A. Molecular analysis of class III peroxidases from cotton[J]. J Cotton Sci， 2006， 10（1）： 53-60.

[10] Hiraga S， Sasaki K， Ito H， et al. A large family of class Ⅲ plant peroxidases[J]. Plant Cell Physiol， 2001， 42（3）： 462-468.

[11] 陳儒鋼， 鞏振輝， 逮明輝，等. 植物基因克隆技術(shù)的發(fā)展與展望[J]. 長江蔬菜， 2009， 23（20）： 13-18.

[12] Duroux L， Welinder K G. The peroxidase gene family in plants： a phylogenetic overview[J]. J Mol Evol， 2003， 57（2）：397-407.

[13] 郭 媖， 郭旺珍， 張?zhí)煺? 兩個陸地棉過氧化物酶cDNA的克隆和鑒定[J]. 作物學報， 2007， 33（6）： 891-897.