液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中22種磺胺及其增效劑殘留量

魏云計 朱臻怡 馮民 張科 王小晉 何健 魏斌 丁濤

摘 要：建立雞肉中22種磺胺及其增效劑多殘留檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品經(jīng)過甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液提取，正己烷脫脂，液-液分配凈化后，C18柱分離，甲醇、水-甲酸水溶液（體積分數(shù)0.1%）為流動相梯度洗脫，采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）正離子多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測，外標法定量。結(jié)果表明：藥物在2.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法的檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在添加量為2.0、5.0、10.0 μg/kg時回收率為61.8%～88.3%，相對標準偏差小于11.3%。該方法簡便快捷，可用于雞肉中磺胺類藥物及其增效劑的多殘留檢測。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雞肉；磺胺；增效劑

Determination of Residues of 22 Sulfonamides and One Sulfonamide Potentiator in Chickens by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WEI Yunji1，ZHU Zhenyi1，F(xiàn)ENG Min1，ZHANG Ke1， WANG Xiaojin1，HE Jian1，WEI Bin1，DING Tao2

（1.Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian223001，China；2.Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）， Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

Abstract： A multi-residue analytical method for the determination of 22 sulfonamides and 1 sulfonamide potentiator in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）. The sample was extracted with formic acid-acetonitrile （1：199， V/V）， and the extract was defatted with n-hexane and cleaned up by liquid-liquid partition. The analytes were separated on a C18 column using a mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1% （V/V） formic acid with gradient elution. The anaysis of the 23 analytes was performed by electrospray ionization （ESI） mass spectrometry under the positive mode using multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. The calibration curves showed good linearity. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 and 2.0 μg/kg， respectively. At the spiked levels of 2.0， 5.0 and 10.0 μg/kg， recoveries ranged from 61.8% to 88.3%， with relative standard deviations （RSD） less than 11.3%. This method is convenient and suitable for the determination of residues of sulfonamides and the potentiator in chicken.

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）； chicken； sulfonamides； potentiator

中圖分類號：TS251.7文獻標志碼：A 文章編號：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，用于預防和治療細菌感染性疾病，具有抗病原體范圍廣、化學性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便、易于生產(chǎn)等特點，能抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些陰性菌，可單獨使用，也常與抗菌增效劑甲氧芐氨嘧啶配伍，通過干擾細菌的二氫葉酸形成，影響細菌核蛋白合成而抑制細菌的生長繁殖。在畜牧業(yè)和獸醫(yī)臨床中，被廣泛用于預防和治療食源性動物疾病?；前奉愃幬镌隗w內(nèi)的作用時間和代謝時間較長，長期使用可能導致在人體中蓄積，進而對人體機能產(chǎn)生危害[1-2]，破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血，并導致病原體產(chǎn)生抗藥性。近年來，動物源食品中磺胺類藥物殘留量超標現(xiàn)象十分嚴重，尤其是在豬、禽、牛等動物源食品中。歐盟規(guī)定肉類食品中的磺胺類藥物的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為單一磺胺類藥物25.0 μg/kg，磺胺類藥物總量100.0 μg/kg，甲氧芐氨嘧啶的最大殘留限量50.0 μg/kg[3-5]。

目前用于檢測磺胺類藥物及其增效劑殘留的方法有高效液相色譜法[6-11]、氣相色譜法[12]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[13]、液-質(zhì)聯(lián)用法[14-20]、免疫測定法[21]等。液相色譜法、氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、免疫測定法大多只能檢測幾種磺胺類藥物，操作比較復雜，而且靈敏度低；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的專屬性和靈敏度，常用于藥物的多殘留分析，目前關(guān)于雞肉中磺胺類藥物檢測的方法已有報道，但是測定的藥物種類不多，連同磺胺增效劑同時測定的文獻尚未有報道。本文經(jīng)過不斷的優(yōu)化改進樣品前處理提取方法與儀器方法，建立了雞肉中22種磺胺和一種磺胺增效劑同時測定的分析方法。經(jīng)過驗證，該法具有快速、準確、檢測限量較低，適用于雞肉磺胺類藥物及磺胺增效劑的殘留量測定，滿足日常檢測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉樣品為市購。

23種藥物標準品：磺胺胍（sulfaguanidine，SG）、磺胺二甲基異嘧啶（sulfisomidine，SMD）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathazole，ST）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲基噁唑（sulfamoxol，SM）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine，SDMD）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺甲氧噠嗪（sulfamethoxypyridazine，SMPD）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯噠嗪（sulfachlorpyridazine，SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadimoxine，SDX）、磺胺甲基異噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine，SCZ）、磺胺二甲異噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SP）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim，TMP），純度均在98% 以上 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均為色譜純；水為超純水；無水硫酸鈉為分析純。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子（ESI）源）、Surveyor液相色譜系統(tǒng)（包括Autosampler 1.3自動進樣器）、MS Pump 2.0質(zhì)譜泵 美國ThermoFisher公司；C18柱（150mm×3.1mm，3.5 ?m） 美國Agilent公司；C18固相萃取小柱（3mL/500mg） 美國Supelco公司；氮吹儀美國Organomation公司；超純水器 美國Millipore公司；離心機 美國Sigma公司；超聲波清洗儀寧波新芝生物科技公司；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60mg）、Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60mg） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液的配制

分別精密稱取上述23種標準品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L標準儲備液，于冰箱中冷凍避光保存。

1.3.2 混合標準溶液的配制

分別準確吸取上述儲備液各適量，置同一容量瓶中，用甲醇稀釋制成含有上述23種物質(zhì)各1.0 mg/L的混和標準溶液。

1.3.3 樣品提取

準確稱取（5.00±0.05）g樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液，于渦旋混合器上混勻1 min，超聲波提取10 min；加10 g無水硫酸鈉，以8000 r/min的速率離心3 min，轉(zhuǎn)移上層有機溶液至20 mL氮吹管中；再用10 mL甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液重復提取殘渣1次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，渦旋混勻，于4 ℃、10000 r/min離心3 min，下層溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.4 儀器參數(shù)及測定條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；進樣量：25 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A為體積分數(shù)為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，流動相A為90%；2.5～4.5 min，流動相A為30%；6.3～10.5 min，流動相A為70%；11～14 min，流動相A為10%；流速：250 μL/min。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）源；正離子方式掃描；噴霧電壓：3000 V；離子源溫度：400℃；鞘氣：45bar，輔助氣：10 bar；毛細管溫度：350 ℃；多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測；優(yōu)化質(zhì)譜條件見表1。

2結(jié)果與分析

2.1 提取溶解的選擇

本實驗在查閱大量參考文獻[15-17，22]的基礎上比較了乙腈、甲酸-乙腈（1∶199，V/V）、甲酸-乙腈（1∶99，V/V）、甲酸-乙腈（2∶98，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。結(jié)果表明：上述幾種溶劑對磺胺類藥物及其增效劑均有較好的效果，使用乙酸乙酯提取時，會提取出較多的脂肪，后續(xù)的脫脂凈化較難，影響色譜柱的使用壽命；乙腈和酸性乙腈都具有沉淀蛋白的效果，提取出的脂肪含量較低，有利于后續(xù)脫脂凈化，由于磺胺類藥物具有弱堿性，易溶于酸性溶液，采用甲酸-乙腈混合溶劑提取效率高于乙腈，同時實驗對甲酸的用量進行優(yōu)化，當隨著甲酸濃度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸-乙腈（1∶199，V/V）混合溶液作為提取溶劑。

2.2凈化方法的比較

雞肉樣品中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，提取過程中需要去除蛋白質(zhì)、脂肪干擾物質(zhì)，實驗研究了液-液分配萃取凈化結(jié)合冷凍高速離心脫脂除蛋白和固相萃取凈化后的效果，同時結(jié)合磺胺類藥物具有弱堿性的化學性質(zhì)。本實驗選取理論上適合其凈化的C18、HLB和MCX小柱進行比較，結(jié)果表明：液-液分配萃取凈化結(jié)合冷凍高速離心處理的方法回收率最高，HLB小柱凈化效果優(yōu)于C18和MCX小柱。樣品經(jīng)正己烷脫脂，高速冷凍離心后大部分脂肪和蛋白質(zhì)被除去，固相萃取小柱對目標物可以凈化和富集，但在操作過程中目標物會損失導致回收率降低，從實驗周期、經(jīng)濟和環(huán)保方面考慮選取正己烷脫脂液-液分配凈化。

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

磺胺類藥物為弱堿性，結(jié)構(gòu)式中具有仲氨基或叔氨基的化學電離性質(zhì)，理論上選用ESI+作為離子化模式，在ESI+離子模式下容易得到H+形成較為穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子峰。實驗采用注射泵直接進樣的方式，將質(zhì)量濃度為1μg/mL的每種標準物質(zhì)，以5μL/min的流速分別注入離子源中在正離子模式下對每種物質(zhì)進行一級質(zhì)譜分析，得到每種分子離子峰，再對每種物質(zhì)的準分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析，得到其相應的碎片離子信息，然后對每種物質(zhì)的二級質(zhì)譜進行碰撞能量、碰撞氣、輔助氣、噴霧電壓、透鏡補償電壓等參數(shù)優(yōu)化，使每種物質(zhì)的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大時為最佳。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

實驗同時測定的物質(zhì)有23種，磺胺類藥物存在多組同分異構(gòu)體，特別是磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪，3種物質(zhì)性質(zhì)極為相似很難將其分離。實驗中比較了Thermo Hypersil GOLD柱（150 mm×2.1 mm，5 ?m），Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m），Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）和Agilent Polaris 5 C18-A柱（100 mm×2.0 mm，5 ?m）對正離子模式下23種物質(zhì)的分離效果、響應強度和峰型。結(jié)果表明：23種物質(zhì)在Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）上有最理想的分離效果、響應強度和峰型?；前奉愃幬锝Y(jié)構(gòu)中含有氨基，水溶液中呈弱堿性，色譜峰易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，當在流動相中加入一定量的甲酸，在酸性條件下促進磺胺類物質(zhì)的電離，提高了離子化效率；同時甲酸有助于色譜柱內(nèi)硅醇基的質(zhì)子化，消除硅醇基與目標物之間的相互作用，減少色譜峰的拖尾，提高了分離效果。實驗比較了在流動相中添加體積分數(shù)為0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%甲酸對目標物的響應和峰型的影響，結(jié)果表明：選用0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相獲得了最好的分離效果、響應強度和峰型?；前奉惢衔飿O性差異大和存在同分異構(gòu)體現(xiàn)象，采用等度洗脫不容易將多組分磺胺分離，需要采用梯度洗脫進行分離。在梯度洗脫的開始階段以10%甲醇作為流動相將極性較強的組分先洗脫出來，3 min后逐漸增加甲醇的比例，提高了同分異構(gòu)體的分離度，使極性弱的組分逐一分離，實現(xiàn)了23種物質(zhì)的有效分離。

2.5線性范圍、檢出限和定量限

為消除基質(zhì)效應按照1.3.3節(jié)處理步驟提取陰性雞肉樣品，配制6個不同質(zhì)量濃度的標準溶液，溶液中磺胺類及其增效劑質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50、100ng/mL；在本法所確定的色譜和質(zhì)譜條件下進樣測定，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，23種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)如表1所示。

在空白雞肉中添加混合標準品，以信噪比（S/N）≥3，確定方法的檢出限為0.5 μg/kg；以信噪比≥10確定方法的定量限為2.0 μg/kg；雞肉樣品中添加2.0 μg/kg 23種混合標準物質(zhì)的MRM色譜圖見圖1。

2.6方法的回收率和精密度

選取陰性雞肉樣品，添加23種磺胺及增效劑混合標準品，添加水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg，每個添加5次平行，按上述優(yōu)化的實驗方法測定個組分的回收率和相對標準偏差，結(jié)果如表5所示。

3 結(jié) 論

實驗建立了雞肉中22種磺胺及其增效劑殘留量同時測定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品經(jīng)過甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液提取，正己烷脫脂，液-液分配凈化，無需固相萃取凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。方法的定量限為2.0 μg/kg，空白雞肉添加回收率為61.8%～88.3%，本方法檢測周期短，靈敏度較高，回收率較好，滿足實際檢測工作的需要，適用于雞肉中22種磺胺及其增效劑殘留量的定性定量分析及確證。

參考文獻：

[1] DIAZ T G， CABANILLAS A G， SALINAS F . Rapid determination of sulfathiazole， oxytetracycline and tetracycline in honey by high-performance liquid chromatography[J].Analytical Letters， 1990， 23（4）：607-616.

[2] 李俊鎖， 邱月明， 王超.獸藥殘留分析[M]. 上海： 上?？茖W技術(shù)出版社， 2002：228-229.

[3] SHAO Bing， DONG Dan， WU Yongning， et al. Simultaneous determination of 17 sulfonamide residues in porcine meat， kidney and liver by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta， 2005， 546（2）：174-181.

[4] 王重洋， 王遠鵬， 王寧， 等.基質(zhì)固相分散-超快速液相色譜法測定牛肉中磺胺類獸藥[J].分析化學， 2013， 41（1）：83-87.

[5] 何金華， 丘錦榮， 賀德春， 等.磺胺類藥物的環(huán)境行為及其控制技術(shù)研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學， 2012（7）：225-229.

[6] 黃冬梅， 黃宣運， 顧潤潤， 等.柱后衍生高效液相色譜法測定蝦中14種磺胺類藥物殘留量[J].色譜， 2014， 32（8）：874-879.

[7] 周明瑩， 馬健， 高湘萍， 等.高效液相色譜法檢測海水中磺胺類藥物殘留[J].漁業(yè)科學進展， 2011， 32（2）：102-105.

[8] 趙海香， 劉海萍， 閆早嬰. 多壁碳納米管固相萃取凈化-高效液相色譜法測定豬肉和雞肉中的磺胺多殘留[J].色譜， 2014， 32（3）：294-298.

[9] GRANJA R H M M， de LIMA A C， SALERNO A G， et al.Validation of a liquid chromatography with ultraviolet detection methodology for the determination of sulfonamides in bovine milk according to 2002/657/EC[J].Food Control， 2012， 28（2）：304-308.

[10] 洪蕾潔， 石璐， 張亞雷， 等.固相萃取-高效液相色譜法測定同時測定水體中的10種磺胺類抗生素[J].環(huán)境科學， 2012， 33（2）：652-657.

[11] 張萍， 陳燕， 王曉玲.固相萃取-高效液相色譜法同時測定雞蛋粉中12種磺胺類藥物殘留量[J].藥物分析雜志， 2010， 30（12）：2338-2343.

[12] 高進.毛細管氣相色譜法測定蜂蜜中磺胺噻唑殘留量[J].湖北大學學報（自然科學版）， 1997， 19（4）：393-394.

[13] 趙曉鳳， 楊中.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉組織中的磺胺二甲嘧啶殘留量[J].飼料工業(yè)， 2007， 28（2）：54-56.

[14] 蔣原， 沈崇鈺， 姚義剛， 等.動物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定[J].分析測試學報， 2009， 28（7）：834-837.

[15] 杜玥， 楊慧元， 徐偉東.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中23種磺胺及其增效劑殘留[J].藥物分析雜志， 2010， 30（3）：471-478.

[16] 劉佳佳， 佘永新， 劉洪斌， 等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中24種磺胺類藥物殘留[J].分析試驗室， 2011， 30（2）：9-13.

[17] 孫玉增， 徐英江， 劉慧慧， 等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海產(chǎn)品中21種磺胺類藥物殘留[J].食品科學， 2010， 31（2）：120-123.

[18] 張巖， 馬曉斐， 呂品， 等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牙膏中16種磺胺類藥物殘留[J].質(zhì)譜學報， 2013， 34（4）：239-246.

[19] 邵金良， 楊東順， 王麗， 等.固相萃取-高效液相色譜法測定同時測定牛奶中13種磺胺殘留[J].分析試驗室， 2014， 33（11）：1322-1325.

[20] 劉思思， 杜鵑， 陳景文， 等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定萊州灣海水養(yǎng)殖區(qū)野生魚肌肉中19種抗生素及2種磺胺代謝產(chǎn)物殘留[J].色譜， 2014， 32（12）：1320-1325.

[21] 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局， 天津科技大學， 中華人民共和國湖北出入境檢驗檢疫局.SN/T 1960—2007進出口動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附法[S].北京： 中國標準出版社， 2007.

[22] 高洋洋， 張朝暉， 劉鑫， 等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中的磺胺增效劑[J].色譜， 2014， 32（5）：524-528.