梓醇對模擬缺血再灌注損傷兔竇房結(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架β—微管蛋白的影響

劉如秀等

摘要：目的 觀察地黃主要有效成分梓醇對模擬缺血再灌注損傷兔竇房結(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架β-微管蛋白（β-tubulin）的影響，探討其治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的機(jī)制。方法 取新生乳兔竇房結(jié)細(xì)胞，分為正常組、模型組及梓醇高、中、低劑量組。以缺氧缺糖模擬缺血、恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)模擬再灌注造成竇房結(jié)細(xì)胞損傷模型。正常組與模型組給予等體積培養(yǎng)基，梓醇高、中、低劑量組給予終濃度為100、20、10 μg/mL藥物，應(yīng)用酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡觀察各組竇房結(jié)細(xì)胞凋亡率、β-tubulin的形態(tài)變化。結(jié)果 模型組細(xì)胞凋亡率較正常組明顯增加（P<0.01），β-tubulin裂解明顯。與模型組比較，梓醇高、中、低劑量組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.01），β-tubulin結(jié)構(gòu)明顯完整，熒光強(qiáng)度明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 梓醇抑制模擬缺血再灌注引起的竇房結(jié)細(xì)胞凋亡，保護(hù)竇房結(jié)β-tubulin形態(tài)可能是地黃治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：梓醇；竇房結(jié)細(xì)胞；缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；β-微管蛋白；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.016

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0059-04

Effects of Catalpol on Apoptosis and β-Tubulin of Rabbit Sinoatrial Node Cells in Vitro Injured by Simulated Ischemia Reperfusion LIU Ru-xiu， PENG Jie， LIU Yu， LIU Jin-feng， WANG Yan-li （Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract：Objective To observe the effects of catalpol， the effective component of Rehmanniae Radix， on atrionector cell apoptosis and β-tubulin in vitro rabbit injured by simulated ischemia reperfusion；To explore the mechanism of treating sick sinus syndrome. Methods Atrionector cells were collected from newborn rabbits. Cells were divided into 5 groups：normal group， model group， catalpol high， medium and low dose groups. Anoxia and aglycaemia were established to simulate ischemia. Atrionector cellular damage models were established by recovering the supply of oxygen and sugar. Normal control group and model group were given the same volume of culture medium， while catalpol high， medium and low dose groups were given medicine with relevant concentrations （100， 20， 10 μg/mL， respectively）. ELISA， FCM， laser scanning confocal microscopy were used to observe apoptosis rate and β-tubulin of atrionector in each group. Results Apoptosis rate of the model group was obviously higher than the normal group （P<0.01）， and β-tubulin cleavage was obvious. Apoptosis rate in catalpol high， medium and low dose groups were significantly lower than that of the model group （P<0.01）；β-tubulin structure were significantly more complete compared with the model group；the fluorescence intensity was significantly higher than that of model group （P<0.01）. Conclusion Catalpol can inhibit atrionector cellular apoptosis caused by simulated ischemia reperfusion. Its protective effects on atrionector β-tubulin may be the mechanism of the treatment of Rehmanniae Radix for sick sinus syndrome.

Key words：catalpol；atrionector cell；ischemia reperfusion；apoptosis；β-tubulin；rabbits

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（以下簡稱“病竇”）是臨床難

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81173447）

治性重大心血管疾病，至今尚無有效根治措施。中醫(yī)藥治療病竇從整體入手，通過多種作用環(huán)節(jié)緩解病情，可改善患者的生存質(zhì)量，提高生存率，延長壽命。病竇的病機(jī)多為心腎陽虛、瘀血阻滯。然善補(bǔ)陽者，必于陰中求陽，且病竇患者久病傷陰，地黃性涼甘潤而能滋陰生血，為治療病竇的常用中藥[1]。梓醇（catalpol）是地黃的主要有效成分之一，有研究顯示，梓醇具有對抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化性損傷、炎癥反應(yīng)等作用[2-4]，但目前鮮見對竇房結(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架蛋白的研究。本研究從降低細(xì)胞凋亡率、保護(hù)細(xì)胞骨架β-微管蛋白（β-tubulin）兩方面揭示梓醇對模擬缺血再灌注損傷兔竇房結(jié)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，為臨床運(yùn)用地黃治療病竇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

出生24 h內(nèi)新西蘭乳兔8只，雌雄不拘，北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，合格證號(hào)11401400000095。

1.2 藥物

梓醇，中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)110808- 201210。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基，美國Thermo公司；一抗：anti-beta tubulin antibody，美國Sigma公司；二抗：Gote Anti-Mouse IgG（H+L）Rhodamine（TRITC），美國Bioworld公司；胎牛血清，美國Gibco公司；低糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胰酶，美國Gibco公司。流式細(xì)胞分析儀（BD，美國），TCS-NT型激光共聚焦顯微鏡（德國），TMC63544防震臺(tái)（美國）。

1.4 竇房結(jié)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

新生24 h內(nèi)乳兔8只，吸入乙醚麻醉，用75%酒精消毒乳兔皮膚及手術(shù)區(qū)，置于冰面上。沿前正中線剪開胸腔，暴露心臟，將心底部大血管剪斷，游離心臟，盡量保留大血管，用PBS清洗心臟3遍，直至無余血。在解剖鏡下分離竇房結(jié)區(qū)域，用PBS清洗分離的組織，將清洗后的組織置于培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪碎，約0.5 mm大小，盡量于冰面上操作。將剪碎的組織置于5 mL離心管中，加入0.1%胰酶10 mL，37 ℃消化15 min，每隔5 min輕搖1次，查看情況，消化完畢，加入5 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，用移液槍上下吹打70次，400 r/min離心5 min，上清液移入另一50 mL離心管，將沉淀組織塊再加入0.1%胰酶10 mL，同前法消化，終止消化后，吹打，離心，取上清細(xì)胞懸液與第1次細(xì)胞懸液合并，重復(fù)1次，將3次所得細(xì)胞懸液合并至50 mL離心管，1500 r/min離心10 min，棄上清液，用含血清培養(yǎng)基6 mL重新懸浮細(xì)胞。取4個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，各加入10 mL培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液等分移入培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，光鏡下觀察可見大量纖維細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞貼壁，將上浮細(xì)胞取出，置于另4個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后更換新培養(yǎng)基，之后每48 h更換培養(yǎng)基[5]。

1.5 造模與分組

以缺氧缺糖模擬缺血，以恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)模擬再灌注。用不含胎牛血清的低糖培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基，放入自制密閉盒中，持續(xù)通入氮?dú)?，充分排盡盒內(nèi)空氣，缺氧缺糖以模擬缺血。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后從密閉盒中取出，更換為正常培養(yǎng)基，恢復(fù)氧和糖的供應(yīng)以模擬再灌注培養(yǎng)3 h。將細(xì)胞分為正常組、模型組和梓醇高、中、低劑量組。梓醇高、中、低劑量組分別加入相應(yīng)濃度藥物（終濃度分別為100、20、10 μmol/mL）預(yù)先培養(yǎng)過夜（約8 h），造模更換培養(yǎng)基時(shí)加入相應(yīng)濃度藥物，造模后取竇房結(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞活力測定

將細(xì)胞接種于96孔板中，分組、造模后，棄培養(yǎng)基，相應(yīng)檢測孔內(nèi)加入MTT工作液100 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，取出，吸除MTT工作液，加入DMSO 100 μL，搖勻，待顏色變化，于酶標(biāo)儀波長570 mm處檢測。

1.7 細(xì)胞凋亡測定

調(diào)整待測細(xì)胞濃度為5×105～1×106個(gè)/mL。造模后，將細(xì)胞消化移至離心管內(nèi)，4 ℃、1500 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，同上法離心，棄上清，重復(fù)3～4次，加入200 μL Binding Buffer，輕輕震蕩，使細(xì)胞懸浮。加入10 μL Annexin V-FITC，輕輕搖勻，避光，室溫反應(yīng)15 min，加入5 μL碘化丙啶，上機(jī)檢測。

1.8 細(xì)胞骨架β-微管蛋白形態(tài)觀察

14 mm蓋玻片放入24孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后，選取生長良好細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吸除培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min；吸除多聚甲醛，加入0.02%Triton，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置15 min打孔。PBS清洗3次，每孔加入相應(yīng)一抗（1∶500 PBS溶液）100 μL，放入濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱孵育過夜；PBS清洗2次，加入二抗（1∶200 PBS溶液）常溫孵育1 h，甘油封片后上機(jī)檢測。取得圖像后，采用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間資料采用完全隨機(jī)方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對竇房結(jié)細(xì)胞活力的影響

MTT比色檢測結(jié)果顯示，模型組活細(xì)胞量低于正常組（P<0.01），表明造模方法可行。梓醇高、中劑量組活細(xì)胞量高于模型組（P<0.01），且呈量效關(guān)系。結(jié)果見表1。

2.2 梓醇對竇房結(jié)細(xì)胞凋亡的影響

模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組（P<0.01）；梓醇高、中、低劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P<0.01），且呈量效關(guān)系，見表1。流式細(xì)胞圖結(jié)果見圖1。

2.3 梓醇對竇房結(jié)細(xì)胞骨架蛋白的影響

模型組平均熒光強(qiáng)度明顯低于正常組（P<0.01）；梓醇高、中劑量組平均熒光強(qiáng)度高于模型組（P<0.01），梓醇低劑量組平均熒光強(qiáng)度與模型組比較無明顯差異，見表1。鏡下觀察結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架染色清晰，骨架完整，分布均勻，線條清晰，基本充滿細(xì)胞質(zhì)；模型組竇房結(jié)細(xì)胞骨架排列紊亂，數(shù)量減少；梓醇高劑量組細(xì)胞骨架較模型組數(shù)量明顯增多，排列有序；梓醇中劑量組細(xì)胞骨架尚完整，但數(shù)量較正常組有所減少；梓醇低劑量組細(xì)胞骨架形態(tài)與模型組比較無明顯差異。結(jié)果見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.梓醇高劑量組；

D.梓醇中劑量組；E.梓醇低劑量組（下同）

3 討論

細(xì)胞凋亡在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育成熟中具有重要作用，竇房結(jié)、房室結(jié)與傳導(dǎo)阻滯細(xì)胞的胚胎發(fā)育及出生后數(shù)周的發(fā)育過程中均有細(xì)胞凋亡發(fā)生，在竇房結(jié)的發(fā)育、成熟過程中，凋亡不足可留下引發(fā)心率失常的基礎(chǔ)，凋亡過度可引起病竇等病變[6]。1993年，Engler等首次從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面證實(shí)，缺血再灌注心肌中存有凋亡細(xì)胞[7]。近年來，隨著方法學(xué)的進(jìn)步和凋亡研究的深入，已發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡之間有著密切的關(guān)系，并且在心臟的生理、病理發(fā)展過程中起重要作用，被認(rèn)為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[8]。細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要形式，抑制細(xì)胞過度凋亡則有防止缺血再灌注損傷的作用[9]?？梢?，缺血再灌注所致的竇房結(jié)細(xì)胞凋亡是病竇的發(fā)病機(jī)制之一。

心肌骨架系統(tǒng)破壞是缺血再灌注損傷主要的發(fā)生機(jī)制之一[10]，有研究表明，人心肌細(xì)胞缺血10 min，微管即發(fā)生排列紊亂[11]。微管是細(xì)胞骨架系統(tǒng)中的主要成分之一，是由微管蛋白組成的長管狀細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，β-tubulin是主要的微管蛋白之一。微管由13條原纖維組成，形成相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，多數(shù)微管纖維處于動(dòng)態(tài)的組裝和去組裝狀態(tài)，通過此過程以實(shí)現(xiàn)其功能。微管形成細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀支架，維持細(xì)胞形狀，支持與固定細(xì)胞器的位置，同時(shí)，微管與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞器位移有關(guān)[12]；另外，微管還通過調(diào)控細(xì)胞膜上L-鈣電流，參與細(xì)胞的電生理活動(dòng)[13-15]。缺血再灌注可導(dǎo)致微管破壞，損傷胞質(zhì)中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脆性增加、失去支持，同時(shí)胞質(zhì)中亞單位線粒體因失去骨架固定與支持發(fā)生移位，從而加速細(xì)胞損傷?？梢姡毖俟嘧⒖蓪?dǎo)致細(xì)胞骨架破壞，從而影響細(xì)胞形態(tài)和功能。

本實(shí)驗(yàn)MTT檢測結(jié)果顯示，模型組與正常組存活細(xì)胞量有明顯差異，表明造模方法可行；梓醇高、中、低劑量組存活細(xì)胞量明顯高于模型組，表明藥物濃度選取有效可行。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞大量凋亡，表明缺血再灌注是導(dǎo)致竇房結(jié)細(xì)胞凋亡的可能原因。梓醇高、中劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，顯示梓醇對抗細(xì)胞凋亡是地黃等藥物治療病竇的可能機(jī)制之一。

顯微鏡觀察顯示，正常組細(xì)胞內(nèi)β-tubulin排列較整齊，且分布均勻，線條較清晰，基本充滿細(xì)胞質(zhì)；模型組β-tubulin數(shù)量較正常組明顯減少，表明缺血再灌注使β-tubulin裂解損傷。β-tubulin的破壞能損傷胞質(zhì)中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜脆性增加、失去支持；同時(shí)，胞質(zhì)中亞單位線粒體因失去骨架支持和固定發(fā)生移位，細(xì)胞膜上L-鈣電流調(diào)控出現(xiàn)紊亂，從而使竇房結(jié)細(xì)胞在電生理功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)生病理改變。而梓醇高、中、低劑量組β-tubulin都有不同程度增加。

綜上，梓醇保護(hù)細(xì)胞骨架β-tubulin是地黃等中藥治療病竇的可能機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉金鳳，汪艷麗，徐利亞，等.益氣通陽方治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征臨床觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（4）：10-12.

[2] Wang Z， Liu Q， Zhang R， et al. Catalpol ameliorates beta amlyloid induced degeneration of cholinergic neurons by elevating brain derived neurotrophic factors[J]. Neuroscience，2009，163：1363- 1372.

[3] Bi J， Jiang B， Liu JH， et al. Protective effects of catalpol against H2O2 induced oxidative stress in astrocytes primary cultures[J]. Neuroscience Letters，2008，442：224-227.

[4] Zhang A， Hao S， Bi J， et al. Effects of catalpol on mitochondrial function and working memory in mice after lipopolysaccharide- induced acute systemic inflammation[J]. Exp Toxicol Pathol，2009， 61（5）：461-469.

[5] 劉如秀，劉宇，汪艷麗，等.乳兔竇房結(jié)細(xì)胞的分離及鑒定[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2013，5（2）：194-195.

[6] James TN. Apoptosis in congenital heart disease[J]. Coron Artery Dis，1997，8（10）：599-616.

[7] Engler RL， Gottlieb AR， Burlesin KO， et al. Myocyte cell death by apoptosis during repefusion[J]. Circulation，1993，88（SuppⅡ）：1-5.

[8] Li Z， Bing OH， Long X， et al. Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat[J]. Am J Physiol，1997，272：2313-2319.

[9] Kaistura J， Cheng W， Reiss K， et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infract size in rats[J]. Lab Invest，1996，74：86-107.

[10] Iwai K， Hori M， Kitabatake A， et al. Disruption of microtubules as an early sign of irreversible ischemic injury. Immunohistochemical study of in situ canine hearts[J]. Circ Res，1990，67（3）：694.

[11] Hein S， Scheffold T， Schaper J. Ischemia induces early changes to cytoskeletal and contractile proteins in diseased human myocardium[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，1995，110（l）：89-98.

[12] Ohtani K， Sakamoto H， Rutherford T， et al. Ezrin， a membrane-cytoskeletal linking protein， is involved in the process of invasion of endometrial cancer cells[J]. Cancer Lett，1999， 147：31-38.

[13] Galli A， DeFelice LJ. Inactivation of L-type Ca channels in embryonic chick ventricle cells：dependence on the cytoskeletal agents colchicine and taxol[J]. Biophys J，1994，67（6）：2296-2304.

[14] Gómez AM， Kerfant BG， Vassort G. Microtubule disruption modulates Ca2+ signaling in rat cardiac myocytes[J]. Circ Res， 2000，86（1）：30-36.

[15] Ganote CE， Vander Heide RS. Cytoskeletal lesions in anoxic myocardial injury. A conventional and high voltage electron micmscopic and immunonuorescence study[J]. Am J Patllol，1987， 129：327-344.

（收稿日期：2015-01-13）

（修回日期：2015-01-29；編輯：華強(qiáng)）