鱟試劑檢測(cè)復(fù)方柳安咖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性研究

趙祎等

【摘 要】 目的：通過(guò)對(duì)復(fù)方柳安咖注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究，建立復(fù)方柳安咖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：采用2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行。結(jié)果：復(fù)方柳安咖注射液經(jīng)80倍及以上稀釋，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）無(wú)干擾作用。結(jié)論：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法適用于復(fù)方柳安咖注射液中內(nèi)毒素的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方柳安咖注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；干擾試驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R927.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）17-0009-04

Abstract：Objective To establish a method for the bacterial endotoxin test of compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection. Method The bacterial endotoxin test was carried out according to the appendix XI E of Chinese Pharmacopoeia （Vol.Ⅱ，edition 2010）.Result The compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection by diluting to a concentration of more than eighty times was noninterference for bacterial endotoxin test of gel-clot. Conclusion The bacterial endotoxins test is suitable for the detection of endotoxin in the compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection.

Keywords：compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection；bacterial endotoxins； interference test

復(fù)方柳安咖注射液又名撒痛風(fēng)注射液，是水楊酸鈉、安替比林、咖啡因的復(fù)方制劑，臨床主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，急、慢性關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)，疼痛，發(fā)熱。該品種收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》第十一冊(cè)[1]。目前，該復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究主要采用HPLC法對(duì)復(fù)方柳安咖注射液中的三種主要成分進(jìn)行含量測(cè)定與分析[2-4]，而對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查未見(jiàn)有關(guān)方面的報(bào)道[5-6]。本實(shí)驗(yàn)參照2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[7]，采用兩個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)來(lái)自3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)12個(gè)批次的復(fù)方柳安咖注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，考察并建立該品種細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Binder FD115烘箱（德國(guó)BINDER公司）；GL-88B旋渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；TW20恒溫水?。ǖ聡?guó)JULABO公司）。

1.2 試藥試劑 鱟試劑（TAL，批號(hào)：1406032，λ=0.5EU/ml，規(guī)格：0.1ml/Amp，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)：1404170，λ=0.5EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司；批號(hào)：1405250，λ=0.25EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/Amp，湛江博康海洋生物有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE，批號(hào)：201175，規(guī)格：120 ml/Amp，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（WBET，批號(hào)：1309230，湛江安度斯生物有限公司；批號(hào)：1311080，湛江博康海洋生物有限公司）；復(fù)方柳安咖注射液（批號(hào)：130707、130902、130903、130904，西南藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)：14041127、14031217、14031317、14031417，四川美大康華康藥業(yè)有限公司；批號(hào)：121206、121207、131002、131003，桂林南藥股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15 min，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30 s。每個(gè)濃度均平行做4管，另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照管。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，放入（37±1）℃的恒溫水浴中，保溫（60±2）min后觀察。將試管緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成不結(jié)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。λc =antilg（∑Χ/4），當(dāng)λc在0.5～2.0λ范圍內(nèi)時(shí)，鱟試劑靈敏度符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果表明2個(gè)批號(hào)的鱟試劑的λc值均在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L的確立 根據(jù)說(shuō)明書中復(fù)方柳安咖注射液用法用量：皮下注射或肌內(nèi)注射，一次2ml（1支），一日1～2次。按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法計(jì)算內(nèi)毒素限值：根據(jù)公式L=K/M（其中K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5EU/（kg·h），M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，按體重60 kg計(jì)算，M=2ml/（60·kg·h）；限值L=150 EU/ml，最終確立復(fù)方柳安咖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為：應(yīng)小于150 EU/ml。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計(jì)算 按公式MVD=CL/λ計(jì)算，L=150 EU/ml，C為供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0 ml/ml，λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度，目前市售TAL最高靈敏度為0.03 EU/ml，可計(jì)算得復(fù)方柳安咖注射液MVD=150 EU/ml/0.03125 EU/ml=4800倍。由此可知，樣品可在稀釋倍數(shù)小于4800倍的情況下進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。

2.4 復(fù)方柳安咖注射液干擾預(yù)試驗(yàn) 每個(gè)生產(chǎn)廠家挑選一批進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水WBET對(duì)復(fù)方柳安咖注射液進(jìn)行稀釋，使稀釋倍數(shù)分別為10、20、40、80、160、320、640倍，將此系列溶液記為樣品供試液，取相應(yīng)濃度樣品稀釋液加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液制成內(nèi)毒素濃度為2λ和0.25λ的樣品供試液，取TAL（批號(hào)：1404170）與上述系列溶液進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)2管。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果可初步了解，復(fù)方柳安咖注射液經(jīng)40倍及以上稀釋對(duì)TAL與內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾。為進(jìn)一步確證有無(wú)干擾因素，用復(fù)方柳安咖注射液80倍稀釋液進(jìn)行如下干擾試驗(yàn)。

2.5 復(fù)方柳安咖注射液干擾試驗(yàn) 為進(jìn)一步確認(rèn)復(fù)方柳安咖注射液在作80倍稀釋后對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用，按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄Ⅺ E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“供試品干擾試驗(yàn)”項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行。將來(lái)自3個(gè)廠家共9批的復(fù)方柳安咖注射液分別用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（WBET）作80倍稀釋。用WBET及80倍稀釋的復(fù)方柳安咖注射液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（WSE）配成濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 EU/ml的試驗(yàn)液，用兩批λ為0.5 EU/ml的不同廠家的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行4管，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果按Es= antilg（∑XS/4）和Et= antilg（∑Xt/4）計(jì)算，其中XS和Xt分別為WBET稀釋系列和80倍稀釋的復(fù)方柳安咖注射液稀釋系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。當(dāng)在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。由表3、4結(jié)果可知，復(fù)方柳安咖注射液在80倍稀釋時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無(wú)干擾作用。

2.6 復(fù)方柳安咖注射液凝膠限度試驗(yàn) 按擬訂的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=150 EU/ml，用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑對(duì)不同廠家的復(fù)方柳安咖注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。取12個(gè)批次的復(fù)方柳安咖注射液樣品，分別用WBET稀釋至600倍濃度的溶液為供試品管，用作300倍稀釋的樣品溶液與濃度為1.00 EU/ml的內(nèi)毒素溶液等體積混合，制成供試品陽(yáng)性管，以0.5 EU/ml的內(nèi)毒素溶液為陽(yáng)性管，WBET為陰性管，（37±1）℃的恒溫，（60±2）min后觀察結(jié)果（均設(shè)2個(gè)平行管），詳見(jiàn)表5。

由表5可知，復(fù)方柳安咖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量均低于150 EU/ml，符合擬定的限值要求。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是近年來(lái)發(fā)展較快的用于檢測(cè)藥品及其中間品內(nèi)毒素污染的一種方法。在美國(guó)、歐洲及日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，大部分的注射劑均采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。我國(guó)于1990年將該法收載入《中國(guó)藥典》，自此，采用該方法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的品種逐年增多。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用鱟試劑對(duì)三批復(fù)方柳安咖注射液進(jìn)行干擾試驗(yàn)，Et結(jié)果均在0.5～2.0 Es范圍內(nèi)，表明復(fù)方柳安咖注射液經(jīng)80倍以上稀釋對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）無(wú)干擾，對(duì)12批不同廠家的復(fù)方柳安咖注射液依法檢驗(yàn)，結(jié)果均符合2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，合格率為100%，其細(xì)菌內(nèi)毒素項(xiàng)可擬訂為：取本品依2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄XI E項(xiàng)下檢查，每1ml中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于150 EU。

復(fù)方柳安咖注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》WS-10001-（HD-1087）-2002，其安全性檢查項(xiàng)目?jī)H有無(wú)菌項(xiàng)。根據(jù)《化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》[8]，生產(chǎn)工藝易污染細(xì)菌內(nèi)毒素的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)。復(fù)方柳安咖注射液臨床使用為皮下注射或肌內(nèi)注射，而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并未收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，為提高復(fù)方柳安咖注射液臨床用藥的安全性，加強(qiáng)對(duì)注射液的質(zhì)量控制，建議增訂該項(xiàng)目。

參考文獻(xiàn)

[1]WS-10001-（HD-1087）-2002.復(fù)方柳安咖注射液[S].

[2]莫文電，石文松，楊帆.HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方柳安咖注射液中3組分的含量[J].中國(guó)藥師，2008，11（9）：1081-1083.

[3]岑淑姬，辛俊衡.HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方柳安咖注射液中水楊酸鈉和安替比林的含量[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（5）：762-763.

[4]陳華文，辛俊衡.HPLC測(cè)定復(fù)方柳安咖注射液中咖啡因的含量[J].首都醫(yī)藥，2008（9）：51-52.

[5]辛俊衡，汪鋅華.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方柳安咖注射液中3組分含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（18）：39-40.

[6]丁培芳，崔郭勤.高效液相色譜法測(cè)定井岡水楊酸鈉水劑中水楊酸鈉含量[J].廣東化工，2011，38（8）：139-140.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99-102.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄212.

（收稿日期：2015.06.04）