兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定

趙海洋 馬子君 路 屹 陳傳好

(蚌埠醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨損傷破壞以及骨關(guān)節(jié)炎(OA)等臨床軟骨疾病過程中的靶細(xì)胞，其生物活性變化情況是探討關(guān)節(jié)損傷及OA等疾病中軟骨細(xì)胞的破壞、病理和治療的重要手段。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞是明了軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的重要方法〔1〕。對軟骨細(xì)胞的增殖，分化以及基質(zhì)合成過程中的變化因素進(jìn)行探討，有助于我們在組織工程化軟骨細(xì)胞培養(yǎng)與基因、蛋白水平上進(jìn)行研究提供合適的條件。當(dāng)前，體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞技術(shù)雖已得到較高的改善和提高〔2，3〕，但尚存在步驟較為繁瑣、實驗投入較高等問題。如何較快地得到大量純化軟骨細(xì)胞成為實驗研究的關(guān)鍵。本研究旨在建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系并分析其生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級4周齡新西蘭幼兔，雌雄不限，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與實驗儀器 Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)，1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶1∶250(Hyclone公司)，胎牛血清(四季青)，雙抗(青霉素、鏈霉素)，甲苯胺藍(lán)、CCK-8(Sigma公司)，兔抗人Ⅱ型膠原抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG(上海生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨分離獲取 健康4周齡新西蘭幼兔腹腔麻醉，備皮，用碘伏腹部及下肢皮膚消毒，無菌操作沿膝關(guān)節(jié)剪開上下剝離皮膚，更換手術(shù)器械和手套，防止碘酒等有機(jī)物污染。打開關(guān)節(jié)腔剪斷韌帶暴露膝關(guān)節(jié)，刮除周圍的骨膜，滑膜等組織，切取關(guān)節(jié)面軟骨組織(以不滲血為度)，置入盛有磷酸鹽緩沖(PBS)液(含青霉素，鏈霉素)的無菌玻璃瓶皿內(nèi)。用含雙抗液的PBS液漂洗培養(yǎng)皿內(nèi)組織塊三次，用眼科剪將其剪碎至1 mm3大小的組織塊。

1.3.2 軟骨細(xì)胞消化 將軟骨塊轉(zhuǎn)移至10 ml離心管內(nèi)。加入5倍體積的0.25%胰蛋白酶置于37℃恒溫箱內(nèi)消化，每15 min震蕩一次，共消化30 min。取出離心管加入含15%血清培養(yǎng)基終止消化，以1 200 r/min，離心5 min，棄上清。用含雙抗的PBS液洗滌一遍，相同轉(zhuǎn)速、時間離心，棄上清。加入0.3%Ⅱ型膠原酶3 ml，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化45 min，每15 min取出震蕩一次，取出離心管加入同體積15%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，以1 200 r/min，離心5 min，棄上清。加含雙抗PBS混勻，使用100目不銹鋼網(wǎng)篩過濾，所得濾液放入另一無菌離心管內(nèi)，1 200 r/min，離心5 min，棄上清，加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打放置。原過濾后的組織塊重新置入離心管內(nèi)，如前法消化45 min，消化后的處理同上。將兩次消化所取的軟骨細(xì)胞混合，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3.3 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 按(3～4)×105細(xì)胞/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)。37℃恒溫，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液1次，待軟骨細(xì)胞貼壁達(dá)80%后傳代。傳代時，倒掉培養(yǎng)基，用含雙抗PBS液輕洗細(xì)胞2次，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶消化液，置恒溫箱1 min左右，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮，間隙增大，終止消化，反復(fù)吹打瓶壁上軟骨細(xì)胞，使其徹底從培養(yǎng)瓶壁脫落，收集細(xì)胞液，800 r/min，離心5 min，1∶2傳代。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 軟骨細(xì)胞生長情況 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長、形態(tài)、細(xì)胞密度等生物學(xué)形態(tài)拍照記錄。按照CCK-8試劑盒說明，連續(xù)檢測8 d，分別用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度(OD值)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.2 細(xì)胞活性檢測 分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)，取9滴細(xì)胞懸液，加入1滴0.4%臺盼藍(lán)，充分混勻，靜置5～10 min，取1滴混合液，注入血細(xì)胞計數(shù)板，計算每毫升培養(yǎng)液內(nèi)活細(xì)胞數(shù)，檢測活細(xì)胞率約90%左右。

1.4.3 甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察 取生長狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞接種于6孔板上，置入含多聚賴氨酸的玻片爬片，棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2次，直接用4%多聚甲醛固定于6孔板中1 h，4℃恒溫。自來水沖洗15 min，蒸餾水洗5 min，然后加甲苯胺藍(lán)浸染2 h，棄除多余液，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4.4 Ⅱ型膠原免疫熒光檢測 取生長良好的軟骨細(xì)胞6孔板內(nèi)爬片，PBS液漂洗3次各5 min，4%多聚甲醛固定10 min，PBS液洗3次各5 min，5%BSA封閉30 min，加入一抗4℃過夜，PBS液漂洗3次各5 min，加入二抗37℃放置30 min以上，行顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞生長情況 軟骨細(xì)胞在原代培養(yǎng)的最初1～3 d增殖速度較快細(xì)胞數(shù)(×103個/ml)分別為0.970 1，1.038 6，1.166 0。4 d以后至第6天細(xì)胞增殖速度較為緩慢分別為1.205 2，1.219 1，1.218 2，進(jìn)入平臺期。第7天細(xì)胞增殖停滯細(xì)胞數(shù)約為1.196 2×103個/ml。兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞在未貼壁前呈現(xiàn)圓球形，懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)。培養(yǎng)12 h左右，細(xì)胞開始呈現(xiàn)貼壁狀態(tài)。48 h后絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁，且部分細(xì)胞開始變形，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多角形，均勻散在生長，出現(xiàn)細(xì)胞分裂相見。7 d細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。9 d后可進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞生長較快，細(xì)胞數(shù)量增多時可呈現(xiàn)“鋪路石”狀外觀圖。細(xì)胞傳至第6代時，細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞生長緩慢，形狀變得不規(guī)則，且壞死脫落細(xì)胞增多，見圖1。

圖1 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)不同時間點的形態(tài)變化(×100)

2.2 細(xì)胞活性檢測 分離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)，檢測活細(xì)胞率約90%左右。傳代后，活性可達(dá)到95%以上。隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞活性開始出現(xiàn)降低狀態(tài)。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色 細(xì)胞爬片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞周圍有少量藍(lán)紫色異染顆粒出現(xiàn)，胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)紫色，胞核呈深藍(lán)色，核仁明顯(圖2)。

圖2 原代培養(yǎng)的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色(×100)

2.4 Ⅱ型膠原免疫熒光染色 Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)的主要成分，Ⅱ型膠原的合成與分泌可作為鑒定軟骨細(xì)胞的特定指標(biāo)〔4〕。熒光顯微鏡下觀察，可見典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，胞核不著色(圖3)。

圖3 原代培養(yǎng)的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色(×200)

3 討論

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞成分，只要通過合適的機(jī)械分離和化學(xué)解離并注意培養(yǎng)方法，就能很好地得到較多的活性高的軟骨細(xì)胞〔5〕。關(guān)節(jié)軟骨表面為一層纖維膜組織，機(jī)械分離軟骨細(xì)胞時注意仔細(xì)剝離。本實驗結(jié)果顯示，采取兩種酶消化及Ⅱ型膠原酶多次消化方法可獲得大量游離、純化的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。正常軟骨細(xì)胞主要分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖，但在連續(xù)多次培養(yǎng)過程中，這種表型逐漸減弱消失，轉(zhuǎn)化生成Ⅰ型膠原，蛋白多糖的分泌水平也會降低，即出現(xiàn)去分化現(xiàn)象〔6，7〕。且在低密度培養(yǎng)情況下，細(xì)胞與細(xì)胞間無法相互影響，細(xì)胞與基質(zhì)失去聯(lián)系，細(xì)胞因子無法提供反饋調(diào)節(jié)，細(xì)胞也會出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，合成分泌Ⅱ型膠原能力下降，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣變化。高密度培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)保持良好。去分化現(xiàn)象較少出現(xiàn)〔8〕。軟骨細(xì)胞沒有特異性標(biāo)志物，但可通過對其分泌的基質(zhì)成分氨基多糖的甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原的免疫熒光染色〔9，10〕。本實驗在甲苯胺藍(lán)染色后結(jié)果證實，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周圍可見藍(lán)紫色異染顆粒，細(xì)胞內(nèi)外GAGs均為強(qiáng)陽性。Ⅱ型膠原免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞胞漿呈綠色，胞核不著色，為強(qiáng)陽性結(jié)果。結(jié)合取材部位證實本實驗所提取培養(yǎng)觀察的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞，且細(xì)胞狀態(tài)良好。綜上，原傳代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可以快速得到大量高純度且增殖活性較高的軟骨細(xì)胞，為進(jìn)一步研究兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞其他生物學(xué)特性及組織生物工程研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 Tew SR，Murdoch AD，Rauchenberg RP，et al．Cellular methods in cartilage research:primary human chondrocytes in culture and chondrogenesis in human bone marrow stem cells〔J〕．Methods，2008;45(1):2-9.

2 宋衛(wèi)東，劉尚禮，李衛(wèi)平，等.人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)法的改良及其特有表型的檢測〔J〕．中華實驗外科雜志，2003;20(2):147-8.

3 孫 壯，褚立希.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展〔J〕．上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;22(4):94-6.

4 Pullig O，Kladny B，Weseloh G，et al．Metabolic activation of chondrocytes in human osteoarthritis.Expression of type Ⅱ collagen〔J〕．Z Orthop Ihre Grenzgeb，1999;137(1):67-75.

5 Manning WK，Bonner WM.Isolation and culture of chondrocytes from human adult articular cartilage〔J〕．Arthritis Rheum，1967;10(3):235-9.

6 Liu G，Kawaquchi H，Oqasawara T，et al．Optimal combination of soluble factors for tissue engineering of permanent cartilage from cultured human chondrocytes〔J〕．J Biol Chem，2007;282(28):20407-15.

7 Schulze-Tanzil G.Activation and dedifferentiation of chondrocytes:implications in cartilage injury and repair〔J〕．Ann Anat，2009;191(4):325-38.

8 沈是銘，毛賓堯.關(guān)節(jié)軟骨的自分泌調(diào)節(jié)〔J〕．中國矯形外科雜志，2000;7(2):173-6.

9 Weinstein T，Evron Z，Trebicz-Geffen M，et al．β-D-xylosides stimulate GAG synthesis in chondrocyte cultures due to elevation of the extracellular GAG domains，accompanied by the depletion of the intra-pericellular GAG Pools，with alterations in the GAGprofiles〔J〕．Connect Tissue Res，2012;53(2):169-79.

10 Kenzaki K，Tsuchikawa K，Kuwahara T.An immunohistochemical study on the localization of typeⅡcollagen in the developing mouse mandibular condyle〔J〕．Okajimas Folia Anat Jpn，2011;88(2):49-55.