珠子參多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的保護(hù)作用

胡 衛(wèi) 陳 濤 王 泉 詹 玲 鞏仔鵬 余雪琴 錢京萍

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

珠子參為五加科植物珠子參〔Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y.Wu et K.M.Feng〕或羽葉三七〔Panax japonicus C.A.Mey.var bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng〕的干燥根莖，具有活血散瘀，補(bǔ)血止血，消腫止痛之功〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示珠子參對(duì)血液及造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤、心血管系統(tǒng)等均有一定的作用〔2〕。目前尚未見(jiàn)到珠子參抗衰老的相關(guān)報(bào)道，而同屬人參、竹節(jié)參提取物能直接清除自由基，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的活性及降低丙二醛(MDA)含量，發(fā)揮抗衰老作用〔3，4〕。本研究觀察珠子參多糖對(duì)D-半乳糖(D-gal)致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，從學(xué)習(xí)記憶能力、清除氧自由基能力等方面探尋其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品 珠子參購(gòu)自宜昌市中醫(yī)醫(yī)院藥房，經(jīng)三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室汪鋆植教授鑒定。香菇菌多糖片(100 mg/片)為武漢迪奧藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào):20110701。

1.2 動(dòng)物 SPF昆明鼠，雌性，體重(20±2)g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.3 儀器與試劑 MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);光學(xué)顯微鏡(廣州光學(xué)儀器廠);離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);D-gal(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):F20080429);MDA、SOD、總抗氧化能力(T-AOC)、CAT 和蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所);其余試劑均為市售分析純。

1.4 衰老模型的建立 在借鑒秦紅兵等〔5〕造模方法基礎(chǔ)上，進(jìn)行必要的改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)小鼠頸背部皮下注射 D-gal溶液(150 mg/kg，使用前用生理鹽水配成溶液)，空白對(duì)照組則皮下給予相同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)6 w。

1.5 珠子參多糖的制備 珠子參根莖購(gòu)買鑒定后，采用水提醇沉法提取珠子參粗多糖〔6〕，提取后的粗多糖保持干燥，使用前配置成50、100 mg/kg 2個(gè)劑量。

1.6 動(dòng)物分組及給藥 將50只小鼠采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分組法分為5組，即空白對(duì)照組(對(duì)照組)、D-gal致衰老模型組(模型組)、香菇多糖對(duì)照組(陽(yáng)性組)、珠子參多糖低、高劑量組(珠子參DD組、珠子參DG組)，每組10只。珠子參多糖低、高劑量組給藥劑量分別為50、100 mg/kg;陽(yáng)性組香菇多糖給藥劑量為100 mg/kg;對(duì)照組和模型組灌胃給予同等體積蒸餾水，每日1次。造模同時(shí)給藥，連續(xù)42 d，灌胃前2 h小鼠禁水禁食。

1.7 小鼠Morris水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮是測(cè)量嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法〔7〕。儀器主要由一直徑為120 cm、高50 cm的圓形水池和一可移動(dòng)位置的平臺(tái)組成，水池上空通過(guò)一攝像機(jī)與監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)連接。水池里水溫控制在(22±0.5)℃，平臺(tái)、水、池壁均染成黑色以隱蔽平臺(tái)，水中不能明顯見(jiàn)到安全平臺(tái)。水池等分為4個(gè)象限，將平臺(tái)放在第三象限中間，在其他3個(gè)象限任選一點(diǎn)面向水池池壁將小鼠放入水中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水池及周圍環(huán)境保持不變。當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間已到或小鼠已爬到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動(dòng)計(jì)算出小鼠在水池中所游過(guò)的路程、時(shí)間及找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即潛伏期)等。試驗(yàn)第6周測(cè)試，分別進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。

1.7.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 用于測(cè)量小鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練2次，每次2 min。每天訓(xùn)練時(shí)將小鼠面向池壁，分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)放入水中，記錄2 min內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。若小鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)上并停留10 s再放入水中，引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶。

1.7.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 用于測(cè)量小鼠對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力。定位航行實(shí)驗(yàn)后第2天實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)撤去平臺(tái)，然后任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄每只小鼠在2 min內(nèi)第一次經(jīng)過(guò)原平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，每只小鼠在2 min內(nèi)經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)以及在原平臺(tái)所在象限內(nèi)逗留的時(shí)間。

1.8 樣本處理和指標(biāo)檢測(cè) 組織勻漿制備:學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，將小鼠頸椎脫臼位處死，迅速取其肝臟和腦組織，剔去結(jié)締組織、稱量、勻漿器研磨后加預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿。3 000 r/min離心10 min，取其上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。分別測(cè)定肝組織和腦組織的MDA含量和SOD活性，以及肝組織T-AOC、CAT活性。

2 結(jié)果

2.1 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠一般狀態(tài)影響 對(duì)照組小鼠行動(dòng)活躍，反應(yīng)敏捷，毛色光滑，食量、飲水均正常;與之相比，模型組小鼠毛發(fā)干枯、無(wú)光澤，行動(dòng)遲緩、自主活動(dòng)明顯降低，食量、飲水略有減少;陽(yáng)性組和珠子參多糖組小鼠各狀態(tài)均有明顯改善。

2.2 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 隨著學(xué)習(xí)時(shí)間的延長(zhǎng)，在5 d訓(xùn)練期間，各組小鼠逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而不斷縮短，表明各組小鼠通過(guò)訓(xùn)練對(duì)于尋找平臺(tái)均有一定的學(xué)習(xí)記憶能力，但表現(xiàn)出了一定的差別。訓(xùn)練的第1天，各組小鼠的平均逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從第2天開始，模型組的平均逃避潛伏期雖有所降低，但與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。而珠子參多糖組與模型組相比平均逃避潛伏期縮短，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異的顯著性越來(lái)越明顯，尤以珠子參DG組更為顯著(P＜0.05，P＜0.01)。模型組潛伏期在5 d內(nèi)下降速度較慢，其進(jìn)步不明顯，說(shuō)明造模小鼠記憶能力受到明顯損害，而香菇多糖、珠子參多糖對(duì)衰老小鼠的記憶能力有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

2.2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組相比，模型組小鼠第1次達(dá)到原平臺(tái)的潛伏期延長(zhǎng)，在原平臺(tái)所在象限內(nèi)逗留時(shí)間縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05，P＜0.01)。而香菇多糖與珠子參DG組均能縮短第1次到達(dá)原平臺(tái)的潛伏期，延長(zhǎng)在原平臺(tái)所在象限內(nèi)逗留時(shí)間，增加穿越原平臺(tái)次數(shù)(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠肝、腦組織SOD活性和MDA含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組肝和腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，而珠子參DG、DD量組小鼠肝臟和腦組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.4 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠肝組織T-AOC、CAT活性的影響 與對(duì)照組相比，模型組肝組織CAT活性明顯降低(P＜0.05);而珠子參DG、DD組小鼠肝組織T-AOC活性明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(x ± s，n=10)

表2 珠子參多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠肝、腦組織SOD活力和MDA含量、肝組織T-AOC及CAT活性的影響(x ± s，n=10)

3 討論

D-gal衰老模型小鼠是研究藥物抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力的重要?jiǎng)游锬Ｐ停蚱渚哂性炷r(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、模型易于建成、重復(fù)性好等特點(diǎn)，自1991年首次構(gòu)建后便得到了廣泛的運(yùn)用〔8〕。近年來(lái)，植物多糖的抗衰老作用引起越來(lái)越多的關(guān)注。研究表明，紅景天多糖、香菇多糖等均具有良好的抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶的功能〔9～11〕。珠子參均為五加科人參屬植物，含總皂苷、多糖、揮發(fā)油和微量元素等多種成分，具有益氣活血，補(bǔ)血止血，消腫止痛之功。本課題組在前期珠子參抗腫瘤研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，珠子參具有良好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)荷瘤小鼠生命、提高荷瘤小鼠免疫功能的功效〔12，13〕。傳統(tǒng)衰老學(xué)說(shuō)認(rèn)為:氧自由基與細(xì)胞凋亡和衰老密切相關(guān)，它通過(guò)參與細(xì)胞凋亡對(duì)衰老進(jìn)程產(chǎn)生影響，減少氧自由基的產(chǎn)生，有延緩衰老的作用。因此我們進(jìn)行了珠子參抗衰老的初步研究，并發(fā)現(xiàn)珠子參多糖對(duì)D-gal所致的衰老小鼠具有良好的抗氧化的作用，用藥組肝臟和腦組織中SOD、T-AOC活性較模型組有明顯升高，而MDA含量顯著降低;且Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有明顯的提高;證實(shí)珠子參多糖具有確切的抗衰老效果。后續(xù)擬進(jìn)一步研究其對(duì)衰老小鼠線粒體端粒酶及有關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以期更深入闡明其抗衰老的可能機(jī)制。

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