中藥方劑對(duì)哲羅鮭受精卵水霉病防治效果的比較研究

李紹戊，劉紅柏

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

水霉病(Saprolegniasis)又稱膚霉病，是淡水養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的真菌寄生性疾病之一。引起水產(chǎn)動(dòng)物水霉病的病原體目前已發(fā)現(xiàn)有10多種［1］，最為常見(jiàn)多為茸鞭生物界(Stramenopila)卵菌門(Oomveota)水霉(Saprolegnia)和棉霉(Achlya)兩個(gè)屬中的一些種類［2］。水霉病流行范圍廣，對(duì)寄主沒(méi)有嚴(yán)格的選擇性，一年四季(特別是晚冬和初春季節(jié))幾乎所有水產(chǎn)動(dòng)物和卵都可被感染［3-5］，為淡水養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，也嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

哲羅鮭(Hucho taimen)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、哲羅魚(yú)屬(Hucho)，是我國(guó)珍稀名貴土著魚(yú)類［6］，也是鮭科魚(yú)類中個(gè)體生長(zhǎng)最快，具有多種優(yōu)良遺傳特性的養(yǎng)殖品種［7］。由于近年來(lái)生物資源過(guò)度開(kāi)發(fā)、水環(huán)境污染等原因，其自然生境遭到了嚴(yán)重破壞。目前，該物種在我國(guó)的分布區(qū)域日益縮小，種群數(shù)量逐漸減少，野生資源基本枯竭，2006年已達(dá)到及毒品瀕危狀態(tài)，被我國(guó)列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物［8-9］。

目前，真菌病的防治多采用化學(xué)殺菌劑，長(zhǎng)期使用易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，降低防病效果，且污染環(huán)境，化學(xué)殘留物為環(huán)境及食品安全帶來(lái)極大隱患［10］。許多植物都具有抗菌能力，且其來(lái)源廣泛，目前世界上約有20 000種植物具有抑菌作用［11］。中藥及天然植物制劑來(lái)源廣、效果好，具有藥用、保健和營(yíng)養(yǎng)等多重作用，且毒副作用低、無(wú)有害殘留、不易產(chǎn)生耐藥性，有極大的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)空間［12］。本研究旨在篩選適用于哲羅鮭受精卵孵化期間能有效防治水霉感染的中藥制劑，為推進(jìn)哲羅鮭養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速健康發(fā)展及開(kāi)發(fā)高效、安全的除霉劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 受精卵及孵化方法

復(fù)方中藥對(duì)哲羅鮭受精卵消毒實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚(yú)類實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。隨機(jī)選取人工采集雌雄配子，授精獲得哲羅鮭受精卵22 000粒，平均分為11組，每組2個(gè)平行，每個(gè)平行1 000個(gè)卵。

將受精卵放入平列槽中流水孵化，孵化期間，水溫為7．3～10．8℃，平均水溫為10．5℃，溶解氧為6．0～9．0 mg/L。

1．2 中藥制備

本實(shí)驗(yàn)選用的3個(gè)自組中藥復(fù)方及2個(gè)單方，分別編號(hào)為A、B、C、D、E(復(fù)方A由苦參、五倍子、黃柏等配任;復(fù)方B由丁香、黃連、土槿皮等配任;復(fù)方C由虎杖、龍膽草等配伍;單方D為土槿皮;單方E為丁香)，所用中藥原料均購(gòu)自哈爾濱世一堂藥店，烘干后備用。

復(fù)方中藥采用水煎和醇提兩種方法對(duì)其有效成分進(jìn)行提取。水煎法按照各復(fù)方配比稱取烘干后的中藥，按傳統(tǒng)方法用砂鍋熬制，濃縮所得藥液至1 mL藥液相當(dāng)于1 g復(fù)方生藥［13］。醇提法參照林楠等［14］方法進(jìn)行。每個(gè)復(fù)方中藥消毒組混合組水煎劑及醇提劑混合體積比為2∶1。單方中藥采用水煎法提取有效成分。

1．3 受精卵消毒

將藥液加入孵化桶中，流水混勻3～5 min，關(guān)水，浸泡30 min，浸泡結(jié)束打開(kāi)循環(huán)水。共設(shè)A、B、C、D、E中藥消毒組10個(gè)，包括5個(gè)正常劑量組和5個(gè)稀釋劑量組及1個(gè)對(duì)照組，每組2個(gè)平行，每個(gè)平行1 000粒卵。其中5個(gè)正常劑量組(每服藥為2 m3水體用量)和5個(gè)稀釋劑量組(每服藥為4 m3水體用量)。從受精卵至發(fā)眼卵孵化期間，每天消毒1次。每日消毒前進(jìn)行活卵、死卵(霉菌感染死亡及非感染死亡)計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每組存活發(fā)眼卵進(jìn)行計(jì)數(shù)。

發(fā)眼率、死卵率、水霉卵比率和其它死卵比率分別為發(fā)眼卵數(shù)、死卵數(shù)、水霉感染引起的死卵數(shù)和其它原因造成的死卵數(shù)與實(shí)驗(yàn)用受精卵總數(shù)的比值。

2 結(jié)果與分析

2．1 中藥方劑正常劑量組消毒效果

按照方法中所述:每日定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵進(jìn)行消毒處理，每服藥為2 m3水體用量，并詳細(xì)記錄魚(yú)卵狀態(tài)及數(shù)量(圖1)。

圖1 中藥方劑正常劑量組消毒結(jié)果Fig．1 Disinfection results of Chinese medicine normal dose groups

圖2 中藥方劑正常劑量組消毒結(jié)果Fig．2 Disinfection results of Chinese medicine dilution dose groups

由圖1可知，對(duì)照組哲羅鮭受精卵孵化過(guò)程中死亡率較高，成功孵化為發(fā)眼率幾率較低僅有32．92%，而水霉菌感染引起的死亡率極高達(dá)到了50．37%，占總死卵數(shù)的75．09%。除D組外，其他4個(gè)中藥正常劑量組實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵的發(fā)眼率均高于對(duì)照組，死卵率特別是水霉菌感染卵比率均低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵發(fā)眼結(jié)果為:B＞A＞D＞C＞對(duì)照＞E，而水霉菌感染導(dǎo)致的死卵結(jié)果為:E＞對(duì)照＞C＞D＞A＞B。且B組實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵的發(fā)眼率64．59%顯著高于對(duì)照組，而水霉感染死卵率的28．67%顯著低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組由其它原因引起的死卵比率表現(xiàn)為:E＞C＞對(duì)照＞A＞D＞B。

2．2 中藥方劑稀釋劑量組消毒效果

按照方法中所述:每日定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵進(jìn)行消毒處理，每服藥為4 m3水體用量，并詳細(xì)記錄魚(yú)卵狀態(tài)及數(shù)量(圖2)。由圖2可知，中藥方劑稀釋組實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵的發(fā)眼及死亡情況與正常劑量給藥組有較大差異，A組表現(xiàn)的尤為明顯。實(shí)驗(yàn)魚(yú)卵發(fā)眼結(jié)果為:D＞B＞C＞對(duì)照＞E＞A，且D和B組發(fā)眼率分別為47．36%和47．09%，差別極小。而水霉菌感染導(dǎo)致的死卵結(jié)果為:對(duì)照＞C＞D＞E＞B＞A，其它原因?qū)е碌乃缆呀Y(jié)果為:A＞E＞對(duì)照＞C＞D＞B。

3 討論與結(jié)論

繼孔雀石綠和甲醛先后被列入魚(yú)類禁用藥物名單后，研究人員相繼對(duì)生化防腐酸［15］、山梨酸鉀等防霉劑［16］的滅菌效果及后期影響進(jìn)行了研究，但未能找到有效的替代藥物。且生化藥的頻繁使用導(dǎo)致水霉菌有耐藥性增強(qiáng)的趨勢(shì)，近年來(lái)越來(lái)越多的生物防治方法開(kāi)始受到廣泛關(guān)注［1］。藥用植物產(chǎn)生的活性物質(zhì)通常具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等功效［17］，是用于水霉病防治的優(yōu)良備選藥物。

3．1 土槿皮及丁香對(duì)水霉病的防治效果

中草藥作為一種生物源的低毒無(wú)污染藥物，日益受到環(huán)保人士及綠色養(yǎng)殖業(yè)者的歡迎。結(jié)合其要用與營(yíng)養(yǎng)的雙重功效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日漸廣泛，也有部分中草藥防治水產(chǎn)動(dòng)物水霉病的報(bào)道。張世奇等［18］對(duì)20種中草藥對(duì)水霉菌的抑菌作用進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明有9種中草藥的水提取液對(duì)水霉菌的孢子及菌絲具有抑制和殺滅作用，其中以土槿皮和山蒼子效果最佳。本研究選取土槿皮和丁香2個(gè)中藥單方對(duì)哲羅鮭受精卵孵化過(guò)程中水霉病防治效果進(jìn)行研究，采用傳統(tǒng)水煎法對(duì)其有效成分進(jìn)行提取，正常劑量組消毒結(jié)果表明:與對(duì)照組相比土槿皮(D組)能有效抑制受精卵水霉感染引起的死亡，結(jié)果與李川等［19］報(bào)道的丁香對(duì)水霉菌生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制效果相一致，可能與其含有多種藥用有效成分［20］有關(guān);而丁香(E組)提取液在抑制水霉生長(zhǎng)方面沒(méi)有效果，且E組受精卵水霉感染死亡率甚至略高于對(duì)照組，推測(cè)可能是由于丁香提取液中某些營(yíng)養(yǎng)成分促進(jìn)了水霉菌的生長(zhǎng)，或者是其藥用成分有效抑制了細(xì)菌等［21-22］微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致水霉生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力降低造成的。也可能與丁香的提取方法有關(guān)，不同有效成分的最佳提取方法也有所不同，有報(bào)道指出丁香葉中總黃酮類化合物的最佳提取工藝應(yīng)采用超聲波輔助的乙醇提取法［23］;郭松年等［24］則認(rèn)為丁香最佳提取方法為80%乙醇浸泡48 h。

3．2 中藥復(fù)方對(duì)水霉病的防治效果

中草藥含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)及生物堿、甾醇類、甙類等生物活性物質(zhì)［25］，作為植物的次生代謝產(chǎn)物豐富，是作用于多種靶點(diǎn)的化合物組合庫(kù)［26］，且根據(jù)不同藥物藥性及所需效果差異，多種配伍組合為中草藥的藥效和種類提供了無(wú)限多種可能，藥物通過(guò)不同的配伍方法可起到意想不到的效果。

本研究選取了3個(gè)自組中藥復(fù)方對(duì)哲羅鮭受精卵孵化過(guò)程中水霉病防治效果進(jìn)行研究，并采用合并其水煎劑及醇提劑的方法，盡可能的保留其藥用有效成分。正常劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本研究選取的3個(gè)自組中藥方劑在哲羅鮭受精卵孵化過(guò)程中水霉病的防治應(yīng)用上表現(xiàn)出了較好好的效果，能有效提高受精卵的發(fā)眼率，降低水霉菌感染造成的死亡，特別是復(fù)方B作用效果極為突出。復(fù)方B中含有丁香、黃連、土槿皮等藥物，一方面促進(jìn)了受精卵的健康孵化，同時(shí)也有效抑制了水霉菌的感染。單方黃連［27］、土槿皮［19］等均有較好的抑菌效果，合理配伍組成的復(fù)方B效果尤為突出，其抑制水霉感染效果顯著優(yōu)于土槿皮水煎劑組(D組)。

3．3 中藥方劑消毒濃度對(duì)水霉病防治效果的影響

藥物的使用濃度是科學(xué)用藥的主要內(nèi)容之一，濃度過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生毒副作用或造成藥物浪費(fèi)及殘留，濃度過(guò)低又達(dá)不到預(yù)期的防治效果。本實(shí)驗(yàn)為篩選較適合的用藥濃度，設(shè)置了中藥方劑的正常劑量組及稀釋組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同一方劑在不同濃度情況下消毒效果差異極大。本實(shí)驗(yàn)中A、B、D正常劑量組均能有效提高哲羅鮭受精卵的發(fā)眼率，抑制水霉菌感染。而稀釋消毒組中A組非感染死亡率急速上升，導(dǎo)致發(fā)眼率極低;B、C、D組也表現(xiàn)為發(fā)眼率降低，死亡率升高。分析這樣的結(jié)果可能與中草藥在具有疾病防治、消毒除菌作用的同時(shí)，還富含多種營(yíng)養(yǎng)元素及活性物質(zhì)有關(guān)。推測(cè)B、C、D組可能是由于有效抑菌成分濃度的下降導(dǎo)致抑菌效果降低，而A組則可能是藥用營(yíng)養(yǎng)成分促生了其他致病微生物或改變了水質(zhì)引起受精卵死亡。因此，在選用中草藥方劑進(jìn)行消毒是，務(wù)必要保證其用藥濃度。

本文選取3種自組中藥復(fù)方和2種單方(土槿皮和丁香)，對(duì)水煎和醇提2種提取方法下不同消毒濃度對(duì)哲羅鮭受精卵孵化期間水霉病防治效果進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明:5種中藥方劑中，復(fù)方B正常消毒劑量組能顯著提高受精卵的發(fā)眼率，降低水霉菌感染造成的死亡，是一種適用于哲羅鮭受精卵孵化期間防治水霉感染的優(yōu)秀中藥制劑。但應(yīng)嚴(yán)格保證中藥消毒劑的濃度及作用時(shí)間，濃度較低時(shí)起不到應(yīng)有的防控作用。

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