鉬鎘聯(lián)合脅迫對山羊腎臟細胞凋亡相關基因表達的影響

王 琦，莊 煜，曹華斌，胡國良，羅軍榮，顧小龍

(江西農業(yè)大學 動物科學技術學院/動物群發(fā)性疾病監(jiān)測和防治研究所，江西 南昌 330045)

鉬和鎘是環(huán)境中兩種污染較重的重金屬元素，隨著工業(yè)的快速發(fā)展，鉬和鎘及其化合物對人類和環(huán)境造成的威脅也日趨嚴重［1-2］。鉬是動、植物生長所必需的微量元素之一，廣泛存在于土壤、空氣、水、植物及動物組織中［3］。鎘是人體不必需的元素，含鎘的污染物能通過多種途徑進入土壤，大氣和水環(huán)境，導致環(huán)境的進一步惡化，甚至通過食物鏈進入體內危害人體健康［4］。腎臟是機體新陳代謝過程中所產生的各種代謝終產物和過剩物質的主要排泄器官之一，同時也是體內藥物及毒物代謝和排泄的重要器官。前人的試驗主要集中在鉬、鎘單獨作用對動植物生長的影響，而較少對鉬鎘互作條件下腎臟細胞凋亡等進行研究。本試驗通過灌服不同濃度七鉬酸銨和不同濃度的氯化鎘溶液，觀察鉬、鎘聯(lián)合脅迫對山羊腎臟細胞凋亡相關基因表達的影響，以期進一步探討鉬、鎘聯(lián)合對山羊腎臟細胞凋亡相關基因表達情況的影響是協(xié)同還是拮抗的作用，從而為動植物鉬、鎘聯(lián)合中毒的病理學研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 實驗動物分組及日糧 本實驗選用63頭健康波爾山羊均購自南昌郊區(qū)某山羊養(yǎng)殖場，隨機分成7組，每組3個重復，選用七鉬酸銨(［(NH4)6Mo7O24·4H2O］)作為實驗鉬源，氯化鎘(CdCl2)作為實驗鎘源，采用(NH4)6Mo7O24·4H2O和氯化鎘水溶液對實驗山羊進行灌服。鉬、鎘劑量按每kg山羊體質量計，對照組(Mo 0 mg/kg+Cd 0 mg/kg)，低鎘低鉬組(Mo 15 mg/kg+Cd 0．5 mg/kg)，低鎘中鉬組(Mo 30 mg/kg+Cd 0．5 mg/kg)，低鎘高鉬組(Mo 45 mg/kg+Cd 0．5 mg/kg)，高鎘低鉬組(Mo 15 mg/kg+Cd 1．0 mg/kg)，高鎘中鉬組(Mo 30 mg/kg+Cd 1．0mg/kg)，高鎘高鉬組(Mo 45 mg/kg+Cd 1．0 mg/kg)，對照組灌服相應劑量去離子水，實驗期50 d。試驗山羊基礎日糧參照NRC(1998)飼養(yǎng)標準山羊營養(yǎng)需要量配制。

1．1．2 樣品采集 實驗開始分別于當天、第25天、第50天每組剖殺3頭山羊，每只山羊迅速取腎臟組織約10 g，分裝于10 mL離心管，液氮速凍后于-80℃保存，用于分子生物學測定。

1．2 實驗方法

1．2．1 總RNA的提取和RNA電泳 總RNA提取按北京全式金生物技術有限公司的TransZol試劑盒進行。用核酸蛋白儀測定總RNA濃度和純度。

1．2．2 PCR引物設計 從 GenBank中檢索獲得羊的 Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-3和肌動蛋白(β-Actin)基因序列。用Primer Express3．0軟件自行設計，分別在相對保守的區(qū)域設計引物和探針，其中探針5′端標記FAM，3′端標記TEMRA，委托上海英駿技術公司合成，引物序列見表1。

1．2．3 反轉錄 按北京全式金生物技術有限公司的試劑盒操作進行。

1．2．4 Real Time(qPCR)反應 采用TaqMan探針法進行Real Time(qPCR)反應，按寶生物工程(大連)有限公司的TaKaRa Premix Ex Taq TM(Probe qPCR)試劑盒操作進行。

表1 引物和探針序列Tab．1 Prime and Probe sequence

1．3 數據分析與統(tǒng)計

使用Excel 2003對實驗數據進行初步整理，然后應用SPSS17．0統(tǒng)計分析軟件對整理后的數據進行單因素方差分析(ANOVA)，記錄各組間的差異顯著性并進行多重比較。所有結果均用平均數±標準差(ˉx±SD)表示。

2 結果分析

2．1 腎臟總RNA提取結果

RNA完整性的檢測結果見圖1，結果顯示總RNA分子完整，28 s、18 s和5 s條帶清晰，28 s大約是18 s的兩倍寬，說明用該RNA提取試劑盒所獲得的RNA是完整的，降解比較低。使用核酸蛋白儀測得該RNA 的 A260/A280值2．0左右，在1．80～2．10之間，說明所提取的 RNA 純度較好。

2．2 鉬鎘聯(lián)合脅迫對山羊腎臟凋亡相關基因表達的影響

2．2．1 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟bcl-2mRNA表達的影響

鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟bcl-2 mRNA表達的影響見表2。組內比較，低鎘低鉬組第25天、50天與第0天比較降低，差異極顯著(P＜0．01)，低鎘中鉬組、低鎘高鉬組、高鎘低鉬組和高鎘中鉬組在實驗期內，腎臟bcl-2mRNA表達隨實驗天數的增加呈降低趨勢，其中低鎘中鉬組第50天與第0天、25天比較差異極顯著(P＜0．01)，低鎘高鉬組第50天與第0天比較差異顯著(P＜0．05)，高鎘低鉬組和高鎘中鉬組第25天、50天與第0天比較差異極顯著(P＜0．01)，高鎘中鉬組第50天與第25天比較差異顯著(P＜0．05)，高鎘高鉬組第25天、50天與第0天比較呈降低趨勢，差異極顯著(P＜0．01)。組間比較，第25天低鎘低鉬組、高鎘低鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較極顯著降低(P＜0．01)，低鎘高鉬組與對照組比較顯著降低(P＜0．05)，第50天低鎘低鉬組、低鎘中鉬組、高鎘低鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較極顯著降低(P＜0．01)，低鎘高鉬組與對照組比較顯著降低(P＜0．05)。

圖1 腎總RNA電泳圖Fig．1 Electrophoresis picture of total RNA in kidney from goat

表2 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟bcl-2mRNA表達的影響Tab．2 Effect of different concentration of M o on the bcl-2m RNA expressions in kidney from goat under Cd stress

2．2．2 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟baxmRNA表達的影響 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟baxmRNA表達的影響見表3。組內比較低鎘中鉬組和低鎘高鉬組第25天與第0天比較呈上升趨勢，差異極顯著(P＜0．01)，低鎘高鉬組第50天與第0天比較呈上升趨勢，差異顯著(P＜0．05)，高鎘低鉬組和高鎘高鉬組在實驗期內，腎臟baxmRNA表達隨實驗天數的增加呈上升趨勢，其中高鎘低鉬組第25天、50天與第0天比較差異極顯著(P＜0．01)，第50天與第25天比較差異顯著(P＜0．05)，高鎘高鉬組第50天與第0天比較差異顯著(P＜0．05)。組間比較，第25天低鎘中鉬組、低鎘高鉬組和高鎘低鉬組與對照組比較極顯著升高(P＜0．01)，第50天低鎘高鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較顯著升高(P＜0．05)，高鎘低鉬組與對照組比較極顯著升高(P＜0．01)。

表3 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟bax mRNA表達的影響Tab．3 Effect of different concentration of M o on the expressions of bax mRNA in kidney from goat under Cd stress

表4 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟caspase-3m RNA表達的影響Tab．4 Effect of different concentration of M o on the expressions of caspase-3mRNA in kidney from goat under Cd stress

2．2．3 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟caspase-3mRNA表達的影響 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟caspase-3mRNA表達的影響見表4。組內比較，低鎘高鉬組在實驗期內，腎臟caspase-3 mRNA表達隨實驗天數的增加呈上升趨勢，其中第50天與第0天比較差異顯著(P＜0．05)。組間比較，第25天低鎘低鉬組、低鎘中鉬組、低鎘高鉬組、高鎘低鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較升高，差異不顯著(P＞0．05)，第 50 天低鎘高鉬組與對照組比較顯著升高(P＜0．05)。

2．2．4 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟cytc mRNA表達的影響 鉬鎘聯(lián)合脅迫下對山羊腎臟cytc mRNA表達的影響見表5。組內比較，低鎘低鉬組、低鎘中鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組在實驗期內，腎臟cytcmRNA表達隨實驗天數的增加呈上升趨勢，其中低鎘低鉬組、低鎘中鉬組和高鎘高鉬組第25天、50天與第0天比較差異極顯著(P＜0．01)，低鎘低鉬組第50天與第25天比較差異顯著(P＜0．05)，高鎘中鉬組第25天與第0天比較差異顯著(P＜0．05)，第50天與第0天比較差異極顯著(P＜0．01)，第50天與第25天比較差異顯著(P＜0．05)，低鎘高鉬組第25天、50天與第0天比較呈上升趨勢，差異極顯著(P＜0．01)，高鎘低鉬組第25天、50天與第0天比較呈上升趨勢，差異顯著(P＜0．05)。組間比較，第25天低鎘中鉬組、低鎘高鉬組、高鎘低鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較極顯著升高(P＜0．01)，低鎘低鉬組與對照組比較顯著升高(P＜0．05)，第50天低鎘中鉬組、低鎘高鉬組、高鎘低鉬組、高鎘中鉬組和高鎘高鉬組與對照組比較極顯著升高(P＜0．01)，低鎘低鉬組與對照組比較顯著升高(P＜0．05)。

表5 鉬對鎘脅迫下對山羊腎臟cytc mRNA表達的影響Tab．5 Effect of different concentration of M o on the expressions of cytc m RNA in kidney from goat under Cd stress

3 討論與結論

細胞凋亡(apoptosis)又稱程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)，是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。細胞凋亡可由物理、化學和生物等因素誘導產生［5］。在眾多的凋亡誘導因子中，重金屬是較早被認識的典型誘導因子之一。高濃度重金屬對機體的重要組織器官如肝、腎及生殖系統(tǒng)等均會造成嚴重損傷，影響機體正常的生理生化代謝、遺傳發(fā)育，嚴重時甚至會造成癌變［6］。

Bcl-2是一個多基因家族，是目前研究的最深入、最廣泛的凋亡調控基因之一。在細胞凋亡過程中，Bcl-2基因家族成員通過相互競爭形成同型或異型二聚體，調控線粒體變化，間接調節(jié)蛋白酶和核酸酶活性，從而雙相調節(jié)細胞凋亡［7］。Bcl-2家族可以分為兩大類:一是抗凋亡基因，主要包括Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL、CED9、Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)等，能保護細胞在受到外界刺激時免于凋亡;二是促凋亡基因，主要有 Bax、Bcl-XS、Bad、Bak、Bid、Bik 等［8］。在本試驗中，山羊腎臟 bcl-2 的表達，鉬、鎘水平與bcl-2的表達有一定的劑量效應關系，高鎘高鉬組山羊腎臟bcl-2的表達極顯著低于對照組，說明鉬、鎘可以抑制山羊腎臟bcl-2的表達，從而促進細胞凋亡。有研究表明bcl-2表達產物可阻止許多刺激物誘發(fā)的細胞凋亡，它抑制的可能是細胞凋亡的共同通路［9］。

Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，Bax是一個促進凋亡的基因，過度表達時會導致細胞凋亡增多［10］。本試驗結果表明，山羊腎臟bax的表達隨鉬、鎘水平提高和攻毒時間的延長而升高，說明鉬、鎘可以促進山羊腎臟bax的表達，引起細胞凋亡。促進凋亡蛋白Bax可能通過與抗凋亡類Bcl-2蛋白形成異源二聚體從而拮抗Bcl-2蛋白的作用，達到促進凋亡的目的［11］。

Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，被認為在細胞凋亡過程中起著關鍵性的作用。在已發(fā)現(xiàn)的Caspase家族中，Caspase-3是哺乳類動物細胞凋亡中的一種關鍵蛋白酶。在正常情況下，胞質中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，只有當細胞凋亡時，才從無活性的酶原形式變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3［6］。本試驗結果顯示，山羊腎臟caspase-3的表達隨鉬、鎘水平劑量的增加和攻毒時間的延長而升高，說明各劑量組的組織細胞凋亡的發(fā)生與caspase-3mRNA基因表達密切相關。Caspase-3家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡機制網絡中居中心地位［12］。

細胞色素C(cytochrome C，Cytc)是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，由兩個無活性的前體分子合成的:前細胞色素C和亞鐵血紅素［13-14］。1996年王曉東等在細胞凋亡的研究中，首次發(fā)現(xiàn)細胞色素C(CytC)就是與細胞凋亡密切相關的凋亡蛋白酶激活因子Apaf-2(apoptotic protease activating factor-2)，隨后又發(fā)現(xiàn)細胞色素C(CytC)是一個來源于線粒體的細胞凋亡信號［15］。本試驗結果顯示，山羊腎臟cytc的表達隨鉬、鎘水平提高和攻毒時間的延長而升高，鉬、鎘水平與cytc的表達有明顯的劑量效應關系，特別是高鎘高鉬組山羊腎臟cytc的表達明顯升高，說明鉬、鎘可以導致山羊腎臟cytc的表達升高，引起細胞凋亡。在哺乳動物細胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡途徑，而細胞色素C正是這條凋亡途徑上的關鍵因子，細胞色素C的釋放是細胞凋亡的關鍵步驟之一［16］。

鉬鎘聯(lián)合脅迫導致山羊腎臟促凋亡基因baxmRNA、caspase-3mRNA及cytc mRNA的表達量升高，抗凋亡基因bcl-2mRNA的表達量下降，從而引起腎臟的損傷，且隨著鉬和鎘濃度的增加，促凋亡基因的表達越高，抗凋亡基因的表達越低。說明鉬鎘聯(lián)合對山羊腎臟細胞凋亡基因的表達呈現(xiàn)協(xié)同毒性效應。

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