球孢白僵菌對假眼小綠葉蟬成蟲高致病力菌株篩選

李萬里，包亞星，童應華

(福建農林大學 林學院，福建 福州 350002)

假眼小綠葉蟬(Empoasca vitis Gothe)屬同翅目(Homoptera)葉蟬科(Icadellidae)小綠葉蟬屬(Empoasca spp．)，是中國茶樹主要害蟲之一［1］。其若蟲、成蟲均危害刺吸茶樹嫩梢芽葉汁液［2］，輕者茶樹嫩梢、芽、葉形成褐色斑點，重者導致焦枯［3］。同時，該刺吸性害蟲也是茶樹病害傳播的主要媒介。該蟲分布廣，世代重疊嚴重，目前主要以化學防治為主，化學試劑的長期使用使該害蟲產生不同程度的抗藥性［4］，農藥殘留降低茶產品的質量。昆蟲病原真菌可通過侵入昆蟲體壁進入蟲體，吸收昆蟲體內營養(yǎng)，并釋放毒素等致死昆蟲，對刺吸式口器的昆蟲有較好的效果［5-6］。球孢白僵菌是一種運用廣泛的病原真菌，其對鱗翅目、鞘翅目、同翅目以及螨類均有較好的防治效果［7-8］。球孢白僵菌對假眼小綠葉蟬若蟲致病力的研究有少量報道［9-10］，但未測定對其成蟲的致病力。本研究用不同球孢白僵菌菌株對假眼小綠葉蟬成蟲進行致病力測定，旨在篩選出對其具有高致病力的菌株，為該害蟲的生物防治提供重要的菌株資源和有效防治途徑。

1 材料與方法

1．1 供試蟲源

2014年3月下旬至4月中旬，于福建省福州市福建農林大學茶園采集假眼小綠葉蟬。將采回的假眼小綠葉蟬用自制吸蟲器吸入透氣的廣口玻璃瓶內(D=7．2 cm;H=9．6 cm)，以帶嫩葉和幼芽的新鮮茶樹枝條(5～6 cm)室內飼養(yǎng)。

1．2 供試菌株

供試球孢白僵菌菌株B3、B187系福建農林大學林學院森林保護教研室保存菌株。BLK、BB、BNH-04菌株來源情況見表1。

表1 供試白僵菌菌株來源Tab．1 The origin of tested Beauveria bassiana strains

1．3 孢子懸液的制備

各菌株于PPDA斜面培養(yǎng)基(去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，蒸餾水定容至1 000mL，pH自然，滅菌)上擴大培養(yǎng)，充分產孢后，用10 mL的0．05%Tween 80無菌水洗下，置于振蕩器上振蕩20 min(180 r/min)。血球計數(shù)板計數(shù)，將各菌株用0．05%Tween 80無菌水配制成(1±0．5)×107孢子/mL的孢子懸液備用。

1．4 高致病力菌株的篩選

1．4．1 接菌 選擇飼養(yǎng)了2 d的健康成蟲作為供試蟲。采用自制的微型噴菌器，以(1±0．5)×107孢子/mL孢子懸液噴霧法接菌。每個廣口瓶裝40～50頭成蟲，置于噴菌器正下方，垂直噴菌3下。并在廣口瓶底部放入血球計數(shù)板，以同樣的方法模擬噴菌，統(tǒng)計單位面積的接菌量。根據(jù)統(tǒng)計，單位面積接菌量為(37．0±0．5)孢子/mm2。

1．4．2 試蟲飼養(yǎng) 在已滅菌的培養(yǎng)皿中放入酒精瓶蓋，瓶蓋中以浸泡無菌水的脫脂棉填滿，用橡皮筋將鮮嫩茶樹枝條(5～6 cm)扎成束后，直插于脫脂棉上，將接菌后的廣口瓶倒扣于培養(yǎng)皿中，貼好標簽，于(25±1)℃，相對濕度(95±1)%的人工氣候箱中飼養(yǎng)，2 d更換1次鮮嫩枝葉，并用浸有無菌水的脫脂棉保濕。每菌株為1處理，每個處理設5個重復，每重復接菌40～50頭成蟲。每12 h觀察和記錄1次各處理假眼小綠葉蟬的死亡情況，并及時將死蟲轉入無菌的培養(yǎng)皿內，用浸泡過無菌水的脫脂棉保濕，置于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察死蟲表面菌絲生長和產孢情況。統(tǒng)計各處理假眼小綠葉蟬死亡數(shù)和僵蟲數(shù)，蟲尸上長出可見的菌絲或孢子粉為有效致死，僵蟲判斷標準參照童應華等［11］和何學友等［12］的方法。以噴等量的0．05%的Tween 80無菌水處理為對照。

1．5 高致病力菌株致死中濃度(LC50)的測定

選擇對假眼小綠葉蟬致病力較強，且僵蟲率較高的菌株，分別以(1±0．5)×108，(1±0．5)×107，(1±0．5)×106，(1±0．5)×105，(1±0．5)×104孢子/mL 的 5 個濃度梯度孢子懸液，噴霧法接菌，每個濃度梯度5個重復，每個重復測定40～50頭健康成蟲，以噴0．05%Tween 80無菌水為對照。飼養(yǎng)、觀察和記錄的方法同 1．4．2。

1．6 數(shù)據(jù)處理分析

試驗數(shù)據(jù)應用Excel2007處理后，采用DPS7．55數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析和Duncan氏新復極差法多重比較［13］。

采用死亡率—時間幾率值分析法，即以時間對數(shù)值為X1，校正死亡率轉換的幾率值為Y1，計算出各菌株線性回歸方程和致死中時(LT50)［14］;再以高致病力菌株的孢子懸液濃度對數(shù)值為X2，校正死亡率的幾率值為Y2，計算出各濃度線性回歸方程和致死中濃度(LC50)。

TDM模型的表述如下:

由于累計死亡概率是時間連續(xù)的變量，不滿足模型模擬的獨立性假設，生物學意義不大，而條件死亡概率的計算依賴于完全相互獨立的時間區(qū)間，它是區(qū)間結束時的實際死亡數(shù)與區(qū)間起始時的存活數(shù)之比，滿足時間變量的獨立性假設。因此，僅考慮不同劑量使試蟲在時間區(qū)間［ti-1，ti］(i=1，2，……，i)內可能發(fā)生的條件死亡概率:

式中:qij表示在時間區(qū)間［ti-1，ti］內由劑量dj(j=1，2，……，j)引起的可能發(fā)生的條件死亡概率，β表示條件死亡率模型的劑量效應的待估參數(shù)(即與劑量效應有關的斜率)，γi表示條件死亡率模型時間區(qū)間［ti-1，ti］內的時間效應參數(shù)估計值［15-16］。

2 結果與分析

2．1 各菌處理后假眼小綠葉蟬的累計死亡率動態(tài)

統(tǒng)計各白僵菌處理假眼小綠葉蟬不同時間段的累計死亡率，結果表明。各菌株對假眼小綠葉蟬均有不同程度的致病力。總體上，各菌株處理第3～7天致死速率較快，死亡高峰期出現(xiàn)在第2．5～5天。其中BLK菌株處理，假眼小綠葉蟬死亡速率較快，處理13 d后，成蟲全部死亡(圖1)。

圖1 不同白僵菌菌株處理后假眼小綠葉蟬的累計死亡率Fig．1 Dynamics of the cumulativemortality rate of Empoasca vitis treated by various Beauveria bassiana strains

進一步比較各菌株處理后3，6，9，12 d的假眼小綠葉蟬累計死亡率，從第3天開始，BLK菌株處理，假眼小綠葉蟬累計死亡率顯著高于其它4株菌株。接菌12 d后，假眼小綠葉蟬累計死亡率達(88．67±1．60)%，極顯著高于其它4株菌株;其次為 BB菌株處理，成蟲累計死亡率為(79．33±1．36)%;最低為BNH-04菌株處理(表2)。

表2 白僵菌處理假眼小綠葉蟬各時段的累計死亡率Tab．2 Cum ulativemortality rate of adult Empoasca vitis treated by various Beauveria bassiana strains

2．2 各菌株對假眼小綠葉蟬的致病力分析

不同菌株對假眼小綠葉蟬致病力的結果見表3。以濃度為(1±0．5)×107孢子/mL的孢子懸液接菌，12 d后，BLK 菌株處理的成蟲累計死亡率、校正死亡率、僵蟲率分別為(88．67±1．60)%、(86．92±1．96)%、(84．67±0．82)%，均極顯著高于其它4株菌株。且各方程擬合程度高并且 R 值均高于0．9，表明所求方程合適。比較各菌株處理的致死中時，BLK菌株處理，成蟲致死速度最快，LT50最短，為6．35 d;BB菌株處理后的LT50次之，BNH-04菌株處理后的LT50最長，為9．61 d。

表3 不同白僵菌菌株對假眼小綠葉蟬的致死效果(12 d)Tab．3 The lethal effects of various Beauveria bassiana strains on Empoasca vitis

2．3 白僵菌BLK菌株對假眼小綠葉蟬不同時段的LC50

研究結果表明，BLK菌株對假眼小綠葉蟬成蟲有較強的致病力和較高的僵蟲率，進一步測定其3，6，9，12 d的LC50，結果見表4。由表可知，各方程擬合程度高并且R值均高于0．9，表明所求方程合適。通過回歸方程計算出各時間段的致死中濃度(LC50)，第6天的LC50為9．539×106孢子/mL。)

表4 不同時段白僵菌BLK菌株對假眼小綠葉蟬的LC50 Tab．4 Median lethal concentration(LC50)on different time of the strain BLK to Empoasca vitis

2．4 BLK對成蟲的時間－劑量－死亡率模型

建立BLK孢子懸液對假眼小綠葉蟬成蟲致病力的時間－劑量－死亡率模型(條件死亡率模型和累計死亡率模型)，獲得條件死亡率模型的劑量效應參數(shù)β和時間效應參數(shù)參數(shù)γi(下標i表示處理后第i天)的估計值，繼而估計出累計死亡率模型的時間效應參數(shù)τi，各參數(shù)估計值見表5。經Hosmer-Lemeshow擬合度檢驗，因 BLK:χ2=0．432 5＜χ20．05(8)=15．507，P=0．999 90＞0．05，即可認為模型擬合中不存在顯著異質性，擬合成功。孢子懸液的劑量效應參數(shù)β為0．452 2，表明該菌株各濃度的孢子懸液對假眼小綠葉蟬成蟲均有一定的致死效果。孢子懸液接菌處理的時間效應參數(shù)γi，在接菌2～7．5 d內呈遞增趨勢，說明在此期間死亡蟲數(shù)每天都在增加，而在接菌2．5～5 d，其γi較前后均相差較大，間接表明該蟲在接菌2．5～5 d死亡數(shù)量較多?？梢夿LK孢子懸液對假眼小綠葉蟬成蟲的致死效應在接菌后2．5～5 d較強。隨著時間的推移，其累計死亡率模型的時間效應參數(shù)逐漸增大，符合真菌對昆蟲致病力的特點［17］。

表5 時間－劑量－死亡率模型和參數(shù)估計(條件死亡率和累計死亡率)Tab．5 The time-dose-mortality modeling and parameter estimation(conditional and cumulativemortality)

3 結論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，5株球孢白僵菌孢子懸液對假眼小綠葉蟬均有一定的致病力。研究結果表明BLK菌株的致病力最強，接菌 12 d后，校正死亡率(86．92±1．96)%，殺蟲速度較快，LT50為 6．35 d。因此該菌株在假眼小綠葉蟬生物防治中有重要的應用價值。

應用白僵菌防治假眼小綠葉蟬方面，前人已做了部分研究。濮小英等［18］應用球孢白僵菌純孢子懸乳劑及其與3%吡蟲啉10%可濕劑的混配劑進行假眼小綠葉蟬田間防治試驗，其防治效果分別達50%和83．4%;蔡國貴［9］從假眼小綠葉蟬僵蟲中分離到1株白僵菌Be2菌株，并選用4株不同來源的球孢白僵菌對假眼小綠葉蟬若蟲進行室內致病力測定，結果表明，接菌Be2菌株7 d后，若蟲累計死亡率達85．7%;展茂魁等［10］應用孢外蛋白酶活性強，且產酶水平高的3株白僵菌菌株對其若蟲進行室內致病力測定，接菌RCEF4687菌株10 d后，若蟲死亡率達82．1%。應用白僵菌對假眼小綠葉蟬成蟲的室內致病力測定未見報導。本研究應用球孢白僵菌對假眼小綠葉蟬成蟲進行致病力測定，篩選出高致病力菌株BLK，其校正死亡率達(86．92±1．96)%。

另外，前人應用其它生物農藥防治假眼小綠葉蟬也取得一定成果。田新湖等［19］應用2．5%EC魚藤酮乳油750倍液防治假眼小綠葉蟬，效果達50．4%;韋靜峰等［20］應用0．2%苦皮藤素乳油500倍液防治假眼小綠葉蟬，8 d防治效果可達76．4%;濮小英等［18］和馮明光等［21］的研究證明病原微生物與其它生物農藥混配，有效地提高了白僵菌對寄主昆蟲的致病力。白僵菌BLK菌株的生物學特性，及其與其它生物農藥的相容性和增效性的研究結果將另文報道。

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