熒光定量RT-PCR檢測(cè)新疆變應(yīng)性鼻炎患者外周血T細(xì)胞IL-2及MEF2 m RNA的表達(dá)水平

趙秀，高麗，張海蓉，姜孝芳(新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊830011)

熒光定量RT-PCR檢測(cè)新疆變應(yīng)性鼻炎患者外周血T細(xì)胞IL-2及MEF2 m RNA的表達(dá)水平

趙秀，高麗，張海蓉，姜孝芳
(新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊830011)

目的探討新疆變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-2及MEF2mRNA的表達(dá)水平，比較其表達(dá)的差異性。方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)53例變應(yīng)性鼻炎患者和39例健康對(duì)照者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-2及MEF2 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果2-△△Ct方法分析結(jié)果顯示變應(yīng)性鼻炎組患者的IL-2mRNA表達(dá)水平為(10.45±2.39)，高于健康對(duì)照組(8.67±2.27)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。變應(yīng)性鼻炎組患者的MEF2mRNA的表達(dá)水平為(3.83±2.23)，健康對(duì)照組為(3.57±1.08)，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。維吾爾、漢變應(yīng)性鼻炎患者的IL-2 mRNA和MEF2 mRNA基因表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論變應(yīng)性鼻炎組基因IL-2mRNA表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，而MEF2mRNA基因表達(dá)在兩組之間無(wú)明顯差異。維吾爾、漢變應(yīng)性鼻炎患者的IL-2mRNA和MEF2 mRNA基因表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

變應(yīng)性鼻炎;IL-2mRNA;MEF2mRNA;RT-PCR

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見(jiàn)病及多發(fā)病，是一個(gè)全球性健康問(wèn)題，目前全球有20%～30%的人群患有AR，而且患病率仍在不斷上升［1］。AR是機(jī)體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎性疾?。?］。

我國(guó)11個(gè)城市多中心成人AR自報(bào)患病率為10%～20%［3］，其中患病率最低的地區(qū)為北京(8.7%)，患病率最高的地區(qū)為烏魯木齊(24.1%)。有研究顯示AR的發(fā)病受環(huán)境的因素影響［4］。安揚(yáng)等［5］在對(duì)新疆過(guò)敏性鼻炎的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)漢族的發(fā)病率(33.36%)明顯高于維吾爾族(19.19%)。研究顯示IL-2 mRNA的分化不均可引起Th1/Th2細(xì)胞分泌失衡從而引起變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，其在變應(yīng)性鼻炎患者及健康人群外周血中的表達(dá)水平具有差異性。而對(duì)于MEF2 mRNA的研究較少，MEF2 mRNA表達(dá)異?？梢餞細(xì)胞異常分化，可能會(huì)引起變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，但目前沒(méi)有直接證據(jù)證明其表達(dá)差異與變應(yīng)性鼻炎有關(guān)。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)變應(yīng)性鼻炎患者和正常對(duì)照者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-2、MEF2 mRNA的表達(dá)水平，旨在探討2種基因在變應(yīng)性鼻炎患者與健康者及不同民族變應(yīng)性鼻炎患者之間的差異，進(jìn)而分析其在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2012年12月-2013年11月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科門(mén)診及病房的變應(yīng)性鼻炎發(fā)作期患者53例為變應(yīng)性鼻炎組，平均年齡(23.47±3.80)歲，其中維吾爾族27例，漢族26例，均在當(dāng)?shù)鼐幼? a以上者，并排除COPD、過(guò)敏性皮炎、高血壓、糖尿病、孕婦及＞60歲老年患者。選取新疆醫(yī)科大學(xué)健康志愿者39例為健康對(duì)照組，年齡(21.43±2.45)歲，既往無(wú)哮喘病史、過(guò)敏性疾病史及心血管疾病史，體檢均正常者。所有受試者均在征求知情同意后接受試驗(yàn)。

1.2 標(biāo)本采集及分離CD4+T淋巴細(xì)胞變應(yīng)性鼻炎組及健康對(duì)照組均采集5 mL外周血，EDTA抗凝，采用免疫磁珠吸附法分離所需的CD4+T細(xì)胞。細(xì)胞分離出后將細(xì)胞移入凍存管中，將凍存管用封口膜封好放入液氮中凍存。

1.3 RNA抽提用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 cDNA合成具體操作按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA放入-20℃冰箱凍存。1.5實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)IL-2、MEF2、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由Life Technologies公司提供。PCR反應(yīng)體系為20μL:SYBR Green master 10μL，ddH2O 6μL，cDNA 2μL，上、下游引物各1μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃5 min總變性，95℃10 s，59℃30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。結(jié)果計(jì)算:通過(guò)相對(duì)定量以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線以同一標(biāo)本在不同管內(nèi)做IL-2、MEF2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其擴(kuò)增效率保持在85%～105%，符合進(jìn)一步試驗(yàn)要求。

2.2 內(nèi)參基因GAPDH及IL-2、MEF2基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線熔解曲線為單一的主峰，說(shuō)明產(chǎn)物為特異性擴(kuò)增，見(jiàn)圖1～6。

2.3 IL-2、MEF2 m RNA定量結(jié)果

2.3.1 變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組IL-2、MEF2 mRNA表達(dá)比較變應(yīng)性鼻炎組IL-2 mRNA基因表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，其表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩組MEF2mRNA基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 GAPDH基因擴(kuò)增曲線

圖2 GAPDH基因熔解曲線

圖3 MEF2m RNA擴(kuò)增曲線

圖4 MEF2 m RNA熔解曲線

圖5 IL-2m RNA擴(kuò)增曲線

圖6 IL-2m RNA熔解曲線

表1 變應(yīng)性鼻炎組和健康對(duì)照組IL-2和MEF2基因m RNA表達(dá)水平(x s)

表1 變應(yīng)性鼻炎組和健康對(duì)照組IL-2和MEF2基因m RNA表達(dá)水平(x s)

組別IL-2 MEF2變應(yīng)性鼻炎組(n=53)10.45±2.39 3.83±2.23健康對(duì)照組(n=39)8.67±2.27 3.57±1.08 t值3.593 0.696 P值0.001 0.488

2.3.2 維吾爾、漢族變應(yīng)性鼻炎患者IL-2和MEF2基因mRNA表達(dá)水平比較維吾爾、漢族變應(yīng)性鼻炎患者IL-2mRNA基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);維吾爾、漢族患者M(jìn)EF2 mRNA基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 變應(yīng)性鼻炎組中維吾爾族與漢族患者IL-2和MEF2基因m RNA表達(dá)水平(s)

表2 變應(yīng)性鼻炎組中維吾爾族與漢族患者IL-2和MEF2基因m RNA表達(dá)水平(s)

族別IL-2 MEF2維吾爾族(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44漢族(n=26)10.48±3.07 3.69±2.85 t值-0.094 0.462 P值0.925 0.646

2.3.3 漢族變應(yīng)性鼻炎患者與健康對(duì)照者IL-2mRNA基因表達(dá)比較漢族變應(yīng)性鼻炎患者IL-2 mRNA基因表達(dá)水平高于健康對(duì)照者，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);漢族患者與健康對(duì)照者M(jìn)EF2 mRNA基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 漢族變應(yīng)性鼻炎患者和健康對(duì)照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

表3 漢族變應(yīng)性鼻炎患者和健康對(duì)照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(s)

組別IL-2 MEF2漢族變應(yīng)性鼻炎患者(n=25)10.48±3.07 3.68±2.85健康對(duì)照者(n=39)8.67±2.85 3.57±1.07 t值2.726 0.274 P值0.008 0.806

2.3.4 維吾爾族變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組的IL-2 mRNA及MEF2基因mRNA水平基因表達(dá)比較維吾爾族變應(yīng)性鼻炎患者組的IL-2 mRNA基因表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而MEF2 mRNA基因表達(dá)水平在維吾爾族變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 維吾爾族變應(yīng)性鼻炎患者和健康對(duì)照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

表4 維吾爾族變應(yīng)性鼻炎患者和健康對(duì)照者IL-2及MEF2基因m RNA水平(±s)

組別IL-2 MEF2維吾爾族變應(yīng)性鼻炎患者(n=27)10.42±1.54 3.97±1.44健康對(duì)照者(n=39)8.79±2.25 3.47±1.15 t值3.472 1.321 P值0.001 0.191

3 討論

變應(yīng)性鼻炎是新疆的高發(fā)病，是由IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病。近年來(lái)的研究認(rèn)為CD4+T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)展中起著重要作用［6］。CD4+T分泌多種細(xì)胞因子，其中Th1、Th2細(xì)胞分泌不均衡可能導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，可促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，IL-2可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的分裂和增生，在T細(xì)胞增殖過(guò)程中具有非常重要作用。在機(jī)體受外源性感染后，IL-2的產(chǎn)生能力及機(jī)體對(duì)IL-2的反應(yīng)能力降低，同時(shí)表達(dá)高親和性的IL-2R，產(chǎn)生免疫抑制物質(zhì)，抑制T細(xì)胞功能，降低機(jī)體免疫功能［7-8］，從而引起炎性疾病的發(fā)生。IL-2還可以直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞分化及抑制IgE分泌，還可能對(duì)B細(xì)胞有直接調(diào)節(jié)作用，并且促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，使體內(nèi)的巨噬細(xì)胞激活，而對(duì)變應(yīng)性疾病產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果證實(shí)在變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組外周血中的IL-2基因表達(dá)具有一定的差異，考慮該差異可能是影響變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的因素;而其在維吾爾族與漢族變應(yīng)性鼻炎患者血中的表達(dá)并無(wú)差異，考慮該基因不是引起維吾爾、漢族變應(yīng)性鼻炎發(fā)病率差異的影響因素。MEF2是肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(myocyteenhancerfactor2，MEF2)，是一種最早發(fā)現(xiàn)與骨骼肌管中的特定的轉(zhuǎn)錄因子，是一種蛋白質(zhì)，但其具有與DNA結(jié)合的活性，MEF2家族可分為MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D［9-10］。MEF2在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，在肝細(xì)胞癌、T細(xì)胞性白血病、T淋巴細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞中均能檢測(cè)到MEF2的存在，其均有異常表達(dá)，提示MEF2 mRNA與這些腫瘤的發(fā)生具有一定的關(guān)系，可能影響腫瘤的發(fā)生［11］。在小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，如果敲出小鼠細(xì)胞中的MEF2C，可以影響T細(xì)胞的形成，這種影響主要是通過(guò)阻斷T細(xì)胞早期的分化發(fā)育產(chǎn)生作用，使小鼠中T細(xì)胞的異常發(fā)育，引起與T細(xì)胞相關(guān)的疾?。?2］。MEF2基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因的表達(dá)，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表達(dá)和分泌。因MEF2基因在心肌、平滑肌等細(xì)胞中廣泛存在，可對(duì)肌細(xì)胞的分化發(fā)育產(chǎn)生影響，故考慮其對(duì)氣道的平滑肌產(chǎn)生作用而影響變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。但本研究結(jié)果證實(shí)變應(yīng)性鼻炎患者血中的MEF2基因水平與正常對(duì)照組并無(wú)明顯差異，故考慮MEF2的表達(dá)差異不會(huì)影響變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。且維吾爾、漢族變應(yīng)性鼻炎患者血中MEF2基因表達(dá)無(wú)明顯差異，考慮該基因不是引起維吾爾、漢族變應(yīng)性鼻炎發(fā)病率差異的主要原因。目前對(duì)于MEF2基因的研究較少，增加樣本含量進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)可能會(huì)得到更確切的結(jié)果。

本研究應(yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)總體變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎組IL-2mRNA的基因水平高于健康對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，變應(yīng)性鼻炎組與健康對(duì)照組MEF2 mRNA的基因水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。維吾爾族與漢族變應(yīng)性鼻炎患者IL-2、MEF2mRNA基因水平均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。提示IL-2基因?qū)ψ儜?yīng)性鼻炎具有一定的作用，而MEF2基因可能對(duì)變應(yīng)性鼻炎沒(méi)有明顯影響，其作用有必要進(jìn)一步研究證實(shí)。由于本研究樣本量較小，如果擴(kuò)大樣本量可能會(huì)得到更確切的線索。由于變應(yīng)性鼻炎引起患者不適［13-14］，影響患者生活工作，所以解決變應(yīng)性鼻炎的基因方面的研究仍需努力。本試驗(yàn)為變應(yīng)性鼻炎今后的治療方面提供了新的理論依據(jù)。

［1］Asher MI，Montefort S，Bjorksten B，etal.Worldwide time trends in the prevalence of symptoms of asthma，allergic rhinoconiunctivitis，and eczema in childhood:ISAAC phases one and three repeat multicountry cross-sectional surveys［J］.Lancet，2006，368 (9537):733-743.

［2］冷改彥，王秋萍.變應(yīng)性鼻炎的流行病學(xué)研究現(xiàn)狀［J］.國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，36(4):238-241.

［3］Zhang L，Han DM，Huang D，eta1.Prevalence ofself-reposed allersic rhinitis in elevenmajor cities in China［J］.IntArch Allergy Immunol，2009，149:47-57.

［4］Masoli M，F(xiàn)abian D，Holt S，et al.The gobal burden of asthma:executive summary of the GINA Dissemination Committee report［J］.Allergy，2004，59(5):469-478.

［5］安揚(yáng)，高麗，劉俊昌，等.烏魯木齊市成年人變應(yīng)性鼻炎流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2005，13(4): 231-232.

［6］Ceuppens J.Western lifestyle local defenses and the rising incidence of allergic rhinitis［J］.Acta Oto-rhino-laryngological Belgica，2000，54(3):391-395.

［7］鄧菊珍.變應(yīng)性鼻炎患者血清IL-2、IL-4的檢測(cè)結(jié)果分析［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，11(21):77-79.

［8］仲人前.細(xì)胞因子與自身免疫性疾病的關(guān)系［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，23(4):200-202.

［9］Estrella NL，Desjardins CA.MEF2 transcription factors regulate distinctgene program in mammalian programs in skeletalmuscle differentiation［J］.JBiol Chem，2015，290(2):1256-1268.

［10］張文煒，徐列明.轉(zhuǎn)錄因子MEF2對(duì)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其生物學(xué)作用［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，20 (4):423-427.

［11］Black BL，Olson EN.Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer factor2(MEF2)proteins［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，1998，14:167-196.

［12］Homminga I，Picters R，Langerak AW，etal.Integrated transcript and genome analyses reveal NKX2-1 and MEF2C as Potential oncogenes in T cell acute lymphoblastic leukemia［J］.Cancer Cell，2011，19(4):484-497.

［13］Stokes JR，Romero Jr FA，Allan RJ，et al.The effects of an H(3) receptor antagonist(PF-03654746)with exogenadine on reducing allergic rhinitis symptoms［J］.JAllergy Clin Immunol，2012，129(2):409-412.

［14］陳雍慧，姜孝芳，楊清，等.熒光定量RT-PCR檢測(cè)新疆維吾爾、漢人群變應(yīng)性鼻炎中IL-2及IL-4 mRNA的表達(dá)水平［J］.免疫學(xué)雜志，2014，30(5):452-456.

Detection IL-2and MEF2 m RNA expression levels in allergic rhinitis patients' T cells of Xinjiang Uyghur and Han by real-timeRT-PCR

ZHAO Xiu，GAO Li，ZHANG Hairong，JIANG Xiaofang
(Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective To research the IL-2 and MEF2mRNA expression levels of Xinjiang allergic rhinitis(allergic rhinitis，AR)patients'peripheral blood CD4+T of lymphocytes，to compared the differences of the two genes between this two groups.Methods Application of real-time RT-PCR technique for detecting 53 caseswith allergic rhinitis and 39 patients with healthy controls CD4+T of peripheral blood lymphocytes in the IL-2 and MEF2 mRNA expression levels.Resu lts 2-△△Ctto analysis the results shows that the allergic rhinitis group's IL-2mRNA expression is(10.45±2.39)，higher than healthy control group(8.67±2.27)，the difference was statistically significant (P＜0.05).The allergic rhinitis group's MEF2 mRNA levels in is(3.83±2.23)，in the healthy control group is (3.57±1.08)，the difference has no statistically significant(P＞0.05).IL-2 mRNA and MEF2 mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).Conclusion Allergic rhinitis group's IL-2 mRNA gene expression levels higher than healthy control group;and MEF2mRNA gene expression has no significant differences between the allergic rhinitis group and the control group(P＞0.05).IL-2mRNA and MEF2mRNA levels in Han and Uygur groups has no statistically significant(P＞0.05).

allergic rhinitis;IL-2 mRNA;MEF2 mRNA;RT-PCR

R34

A

1009-5551(2015)06-0721-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.015

2015-03-12］

(本文編輯張巧蓮)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2013211B55);國(guó)家自然科學(xué)基金(81260006)

趙秀(1988-)，女，在讀碩士，研究方向:呼吸道變應(yīng)性疾病。

姜孝芳，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向:呼吸道變應(yīng)性疾病發(fā)病機(jī)制，E-mail:xinjiangjxf@163.com。

通信作者:高麗，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向:呼吸道變應(yīng)性疾病，E-mail:xjmugaoli@sina.com。