Midkine-a通過(guò)限制心肌細(xì)胞總數(shù)的方式阻礙斑馬魚(yú)胚胎心臟生長(zhǎng)

陳靜，Luo Jing，Hitchcock Peter

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福州 350117；2.美國(guó)密歇根大學(xué)安娜堡分?？唆敻裱劭浦行?，安娜堡 48103）

研究報(bào)告

Midkine-a通過(guò)限制心肌細(xì)胞總數(shù)的方式阻礙斑馬魚(yú)胚胎心臟生長(zhǎng)

陳靜1*，Luo Jing2，Hitchcock Peter2

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福州 350117；2.美國(guó)密歇根大學(xué)安娜堡分?？唆敻裱劭浦行模材缺?48103）

目的探討一種可溶性的外分泌因子midkine-a在斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中的功能。方法 在整體胚胎上做midkine-a RNA的原位雜交實(shí)驗(yàn)；利用原有的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg（pmidkine-a：EGFP），動(dòng)態(tài)觀察胚胎從出生到心臟發(fā)育成形這一段時(shí)間心臟熒光表達(dá)情況；將原有的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)體系Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎進(jìn)行熱休克而過(guò)表達(dá)midkine-a，觀察胚胎心臟表型；利用Tg（pcm lc2：dsRed）魚(yú)系胚胎的心肌細(xì)胞核帶有紅色熒光，能進(jìn)行單個(gè)心臟心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)這一特點(diǎn)，將雜合的Tg（phsp：midkine-a：EGFP）魚(yú)系與純合的Tg（pcmlc2：dsRed）魚(yú)系交配，以得到Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）的雜合胚胎，對(duì)其進(jìn)行熱休克而過(guò)表達(dá)midkinea，計(jì)算每個(gè)胚胎心臟內(nèi)心肌細(xì)胞的總數(shù)；用嗎啉寡聚核苷酸（morphonino，MO）阻礙新生胚胎內(nèi)的midkine-amRNA表達(dá)，觀察胚胎心臟表型。結(jié)果原位雜交試驗(yàn)證實(shí)midkine-a在胚胎48 hpf（hour post fertilization，受精后，用來(lái)標(biāo)記斑馬魚(yú)胚胎年齡）大時(shí)表達(dá)于心臟；轉(zhuǎn)基因Tg（pmidkine-a：EGFP）胚胎在72 hpf時(shí)其EGFP表達(dá)于心臟；Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎在過(guò)表達(dá)midkine-a后心臟變??；嗎啉寡聚核苷酸敲除midkine-a對(duì)胚胎心臟發(fā)育無(wú)影響；最后在Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）魚(yú)系胚胎內(nèi)過(guò)表達(dá)midkine-a導(dǎo)致其單個(gè)心臟內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)目變少，與其小心臟外形吻合。結(jié)論midkine-a在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于胚胎心臟；過(guò)表達(dá)midkine-a導(dǎo)致胚胎心臟內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)減少及心臟變?。磺贸齧idkine-a則對(duì)胚胎心臟發(fā)育無(wú)影響。

斑馬魚(yú)胚胎；心臟發(fā)育；midkine-a；心肌細(xì)胞池

midkine是一種可溶性細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能與小分子肝素結(jié)合，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及存活方面起著重要的多樣化的作用［1］。它是一個(gè)13 kda的分泌分子，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域能與肝素結(jié)合，N端結(jié)構(gòu)域能與受體結(jié)合，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間以雙硫鍵相連［1］。Midkine-a廣泛地表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)［2］、免疫系統(tǒng)、腫瘤組織及心臟等器官或組織內(nèi)。midkine能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)［3］，促進(jìn)細(xì)胞分裂、存活、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨藥現(xiàn)象發(fā)生等［1］。

不同于哺乳動(dòng)物只有一種midkine，由于基因重復(fù)的結(jié)果midkine在斑馬魚(yú)體內(nèi)有2種亞型：a型和b型［3］。midkine-a首先表達(dá)于斑馬魚(yú)胚胎尾芽期的胚胎的軸旁中胚層，而后midkine-a表達(dá)逐漸開(kāi)始集中于神經(jīng)組織如頭部的神經(jīng)外胚層、神經(jīng)管及脊髓［3］。在16 hpf時(shí)，midkine-a開(kāi)始出現(xiàn)在體節(jié)中［3］。故而人們普遍地認(rèn)為midkine-a在神經(jīng)組織形成及胚胎正常發(fā)育中起著重要的作用［2，3］。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)idkine-a亦表達(dá)于斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜的干細(xì)胞之內(nèi)，并作為Id2a信號(hào)通路的主要成員調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞周期進(jìn)程［4］。此外midkine-a也存在于成年哺乳動(dòng)物的心臟［5］，可能通過(guò)其抗細(xì)胞凋亡的功能在心肌缺血時(shí)保護(hù)心臟［6］。在成年斑馬魚(yú)受到心肌損傷而導(dǎo)致的心臟再生過(guò)程中，再生心肌內(nèi)midkine-a基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，故而其可能在心臟再生中也起著一種積極的保護(hù)性［7］。我們的研究表明midkine-a也表達(dá)于斑馬魚(yú)胚胎心臟區(qū)域內(nèi)，盡管如此，midkine-a在胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中的功能尚不明了，而且不一定與它在成年心臟或心肌再生中的作用平行一致。由此促使我們開(kāi)始探索midkine-a在心臟發(fā)育中的作用。類(lèi)似于midkine-a，midkine-b也是一種能與小分子肝素結(jié)合的可溶性細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和血管新生的作用［1］。有報(bào)道表明midkine-b在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的原腸胚期中起著促進(jìn)神經(jīng)板圖式形成的作用，它能調(diào)節(jié)神經(jīng)板邊緣的干細(xì)胞的分化［6］。在斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)，midkine-a和midkine-b分別表達(dá)于互不重疊的區(qū)域［3］。而我們的前期數(shù)據(jù)表明midkine-b并不表達(dá)于斑馬魚(yú)成年或胚胎心臟，故在本系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)忽略midkine-b。

斑馬魚(yú)的胚胎心臟發(fā)育可分為如下過(guò)程：心臟前區(qū)形成，心臟前體細(xì)胞遷移，心腔形成及心袢形成。在斑馬魚(yú)胚胎原形形成之前心臟前體細(xì)胞分散在胚胎腹側(cè)及側(cè)面的區(qū)域內(nèi)［7］。在胚胎受精后12 h（12 hpf，hours post fertilization），胚胎兩側(cè)的心臟前體細(xì)胞向中線前部遷移，形成一個(gè)平行對(duì)稱的心臟前區(qū)域［8］。而后心臟前區(qū)域分化出位于中間的心內(nèi)膜前體細(xì)胞群，及位于側(cè)部的心肌前體細(xì)胞群［8］。在胚胎處于13-原節(jié)期時(shí)（15.5 hpf），心臟前區(qū)域分出前心室前體細(xì)胞群及前心房前體細(xì)胞群。在19 hpf時(shí)心肌前體細(xì)胞層在中線上匯集并形成一個(gè)圓錐形結(jié)構(gòu)［8］。該圓錐形結(jié)構(gòu)在22 hpf時(shí)進(jìn)一步演化成一個(gè)位于胚胎前后軸上的初始心管。到48 hpf時(shí)，這個(gè)心管歷經(jīng)心腔形成，右向心袢形成，心瓣膜生成，血循環(huán)形成，形成一個(gè)成熟的有功能的心臟［8］。

我們初步的研究表明：①原位雜變?cè)囼?yàn)證實(shí)midkine-a表達(dá)于發(fā)育中的心臟；②Midkin-a基因5’端上游2.2 kb長(zhǎng)的DNA序列能引導(dǎo)EGFP在胚胎體內(nèi)普遍表達(dá)，包括心臟或的表達(dá)；③過(guò)表達(dá)midkine-a導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎心臟變??；④MO敲除midkine-a對(duì)胚胎心臟發(fā)育沒(méi)有影響。⑤過(guò)表達(dá)midkine-a導(dǎo)致心臟內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)減少，與小心臟的表型一致。這些數(shù)據(jù)表明，midkine-a在斑馬魚(yú)胚胎心臟的發(fā)育中起著重要的作用，能通過(guò)限制心肌細(xì)胞總數(shù)的方式調(diào)整發(fā)育中的心臟生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)

所有實(shí)驗(yàn)斑馬魚(yú)及胚胎均為清潔級(jí)，來(lái)源于野生型AB品系［10，11］。用于交配的30只斑馬魚(yú)均為24月齡，體重0.11～0.23 kg。實(shí)驗(yàn)操作地址為美國(guó)密歇根大學(xué)安娜堡分校克羅格眼科中心。斑馬魚(yú)胚胎存放于27℃的海鹽水（60μg/mL Instant Ocean Salts；Aquarium Systems，Mentor，OH）中。房間明暗周期為14 h/10 h［12］。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（phsp：midkine-a：EGFP）是實(shí)驗(yàn)室原有的魚(yú)系。其轉(zhuǎn)入的基因?yàn)闊嵝菘说鞍讍?dòng)子連接midkine-a和EGFP（加強(qiáng)綠色熒光蛋白，enhanced green fluorescent protein）的融合基因。在熱休克處理下，該株魚(yú)系會(huì)過(guò)表達(dá)midkine-a：EGFPmRNA。Tg（pmidkine-a：EGFP）是另外一株轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系，轉(zhuǎn)入基因?yàn)閙idkine-a。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’端上游2.2 kb的啟動(dòng)子片段連接EGFP報(bào)告蛋白。該株魚(yú)系胚胎在有midkine-a表達(dá)的組織和器官會(huì)表達(dá)midkine-a：EGFP融合蛋白而發(fā)出綠色熒光。Tg（pcmlc2：dsRed2-nuc）是另外一株能在胚胎心臟心肌細(xì)胞核發(fā)出紅色熒光的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因魚(yú)系，其轉(zhuǎn)入的基因?yàn)樾募√禺愋曰蚣∏虻鞍纵p鏈2的啟動(dòng)子連接紅色熒光蛋白（r ed fluorescent protein，RFP）（Stainier 2001）。該RFP蛋白具有核定位信號(hào)引導(dǎo)RFP在心肌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)［8］。建立這種魚(yú)系的目的是為了更好的心肌細(xì)胞熒光顯影并對(duì)某單個(gè)心臟內(nèi)的心肌細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2 原位雜交

斑馬魚(yú)胚胎的全組織包埋原位雜交實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［12］。首先收集48 hpf的胚胎，而后對(duì)這些胚胎進(jìn)行固定、滲透化及預(yù)雜化。雜化在70℃下進(jìn)行。探針為與midkine-a mRNA相對(duì)應(yīng)的地高辛標(biāo)記的小片段反義RNA。接下來(lái)這些胚胎標(biāo)本經(jīng)洗滌后加入有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體。顯色反應(yīng)于室溫下的堿性Tris緩沖液內(nèi)進(jìn)行，而后胚胎標(biāo)本在Zeiss Image A2蔡司顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）下顯像。

1.3 心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)

Tg（pcm lc2：dsRed2-nuc）胚胎用來(lái)對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將雜合子斑馬魚(yú)Tg（phsp：midkine-a：EGFP）line與純合子Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）斑馬魚(yú)交配，后代胚胎基因型有一半是雙重轉(zhuǎn)基因胚胎

Tg（phsp：midkine-a：EGFP）+/ˉ；Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）+/ˉ。這些胚胎在熱休克處理下能普遍的過(guò)表達(dá)midkine-a：EGFP，并且它們的心臟心肌細(xì)胞核也能發(fā)出紅色熒光。此種交配產(chǎn)生的另一半胚胎具有pcmlc2：dsRed-nuc+/ˉ基因型，但不能過(guò)表達(dá)midkine-a，這些胚胎可用來(lái)做心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。在熱休克處理后，在熒光顯微鏡下根據(jù)心臟有無(wú)綠色熒光將這兩組胚胎分開(kāi)。這些胚胎存養(yǎng)在0.003%苯硫脲海鹽水中以抑制表皮色素形成。而后在72 hpf時(shí)將這些胚胎置入玻片上的含10%胎牛血清的Lebovitzˊs L15培養(yǎng)液中，蓋上蓋玻片后立即在熒光下顯像。在每張心臟圖像上進(jìn)行心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)［7］。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。每次試驗(yàn)的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都包括10只胚胎。用來(lái)熒光顯像及心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)的胚胎則從這些胚胎中隨機(jī)選擇。

1.4 熱休克處理

多次熱休克處理的方法：將Tg（phsp：midkinea：EGFP）胚胎在15、20、24、27、30及48 hpf大時(shí)，置于37℃持續(xù)1 h，而后將胚胎置于24℃的環(huán)境中恢復(fù)。這種熱休克處理方法能在最大程度上促進(jìn)midkine-a的表達(dá)，同時(shí)野生型胚胎也置于相同條件的環(huán)境中作為對(duì)照。胚胎心臟于50 hpf時(shí)顯像。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組平均值之間差異顯著性用Statistica 7.0（StatSoft，Inc.，Tulsa，OK）軟件中的雙向分差分析計(jì)算，而后用Fisher LSD實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果用平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示，“*”表明組之間差異具有顯著性，P≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 早期斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中m idkine-a在心臟表達(dá)

我們的原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明midkine-a mRNA在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中如48 hpf時(shí)即表達(dá)于心房和心室（圖1）。與此表達(dá)一致的是，在72 hpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（pmidkine-a：EGFP）的胚胎內(nèi)，midkine-a 5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2.2 kb的DNA片段即可誘導(dǎo)其后的融合基因midkine-a：EGFP在心臟特異性的表達(dá)（圖2）?？偠灾?，midkine-a能在早期胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中表達(dá)于心臟，這說(shuō)明midkine-a在心臟發(fā)育過(guò)程中可能扮演了特定的角色。

2.2 胚胎體內(nèi)m idkine-a過(guò)表達(dá)導(dǎo)致心臟發(fā)育異常變小

為了理清midkine-a的功能，我們利用了Tg（phsp：midkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)以進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)midkine-a對(duì)心臟發(fā)育的影響。該魚(yú)系的轉(zhuǎn)基因是由熱休克基因的啟動(dòng)子與其后的融合基因midkine-a和EGFP報(bào)告基因組成。在較高的環(huán)境溫度下，熱休克基因的啟動(dòng)子被激活，誘導(dǎo)其后的midkine-a和EGFP融合基因的表達(dá)。當(dāng)這些胚胎用熱休克處理（方法詳見(jiàn)材料和方法，及圖3）后，這些胚胎體內(nèi)的midkine-a：EGFP普遍的大量的整體表達(dá)，包括在胚胎心臟的表達(dá)，所以在熒光下整體胚胎包括心臟呈綠色。由于心臟位于胚胎腹側(cè)的體表下，故帶綠色熒光的心臟能很容易地與其他組織分辨開(kāi)來(lái)（圖4B，B’）。這些心臟與對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因胚胎心臟比較，其心臟明顯變小并伴有輕度的心包積液（圖4C，D）。除了心臟變小的表型外，這些胚胎還并發(fā)心動(dòng)過(guò)緩的異常體征。轉(zhuǎn)基因胚胎心臟平均跳動(dòng)23次/分，而對(duì)照組胚胎的正常心跳平均為126次/分。（midkine-a整體表達(dá)于胚胎內(nèi)，包括心臟、視網(wǎng)膜、骨骼肌等。由于心臟位于胚胎頭部腹側(cè)的體表下，故帶綠色熒光的心臟能很容易地與其他組織分辨開(kāi)來(lái)。

注：斑馬魚(yú)胚胎在48 hpf時(shí)的midkine-a全組織包埋原位雜交實(shí)驗(yàn)。方向：A，anterior（前方）；P，posterior（后方）；V，ventral（腹面）；D，dorsal（背部）。箭頭指向，A，atrium（心房）；V，ventricle（心室）。圖1 原位雜交顯示midkine-a mRNA存在于胚胎的心臟中（×20）Note.The whole-mount in situ hybridization of48 hpf embryos showing the heart.Orientation：A，anterior；P，posterior；V，ventral；D，dorsal.The arrows point to A，atrium；V，ventricle.Fig.1 In situ hybridization shows thatmidkine-amRNA exists in a 48 hpf embryonic heart

注：Tg（pmidkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎在心臟內(nèi)表達(dá)EGFP，證實(shí)midkine-a在胚胎發(fā)育早期就表達(dá)于心臟。箭頭指向動(dòng)脈球（bulbus arteriosus）和心室（ventricle）。方向：A.Anterior（前方）；P.Posterior（后方）；V.Ventral（腹面）；D.Dorsal（背部）。圖2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（pmidkine-a：EGFP）胚胎在心臟內(nèi)表達(dá)EGFP（×100）Note.Tg（pmidkine-a：EGFP）transgenic fish expresses EGFP in the heart，demonstrating thatmidkine-a expresses in the early developmental stage of the embryonic heart.The arrows point to the bulbus arteriosus and the ventricle.Orientation：A，anterior；P，posterior；V，ventral；D，dorsal.Fig.2 The embryo of transgenic fish Tg（pmidkinea：EGFP）specifically expresses EGFP in the heart

注：熱休克處理示意圖表明對(duì)Tg（phsp：midkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行熱休克處理以誘導(dǎo)midkine-a：EGFP蛋白大量表達(dá)。胚胎分別在15、20、24、27、30、48 hpf時(shí)予以37℃1 h的熱處理后，轉(zhuǎn)移至24℃恢復(fù)。圖3 熱休克處理示意圖Note.Diagram showing the regimen of heatshock treatments of Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos at 15，20，24，27，30，48 hpf to induce the maximum production of midkine-a.For each heatshock treatment，embryos were exposed in a 37℃ incubator for 1 h and then recovered in the 24℃ incubator.Fig.3 Diagram of the heat shock treatment

2.3 嗎啉寡合核苷酸敲除m idkine-a對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎心臟發(fā)育無(wú)影響

與過(guò)表達(dá)midkine-a不同的是，用嗎啉寡合核苷酸（morpholino，MO）阻礙midkine-a的轉(zhuǎn)錄對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎心臟發(fā)育沒(méi)有影響。在0～48 hpf之間，斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育歷經(jīng)心腔形成、右向心袢形成、心瓣膜生成、血循環(huán)形成，最終形成一個(gè)成熟的心臟。而我們從0～120 hpf仔細(xì)觀察了midkine-a有機(jī)體（morphant，指注射了嗎啉寡合核苷酸的胚胎）的心臟表型，未見(jiàn)明顯異常（圖5）。在82 hpf時(shí)midkine-a有機(jī)體心臟發(fā)育正常，心腔形成，及右向心袢、心瓣膜、血循環(huán)形成無(wú)異常，與對(duì)照組無(wú)差別，未見(jiàn)小心臟或心包積液的產(chǎn)生。這說(shuō)明midkine-a的存在對(duì)于斑馬魚(yú)胚胎心臟的正常發(fā)育不是必需的。本midkine-a嗎啉寡合核苷酸阻礙midkine-a翻譯作用的有效性及特異性用midkine-a及midkine-b cD-NA體外翻譯實(shí)驗(yàn)（圖6）證實(shí)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)midkine-a嗎啉寡合核苷酸能有效地阻礙midkine-a cDNA體外翻譯；而無(wú)阻止同源基因midkine-b cNDA體外翻譯的作用，證實(shí)了其有效性及特異性。

注：熱休克引導(dǎo)midkine-a：EGFP在48 hpf Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎中的表達(dá)。從野生型與半合子Tg（phsp：midkine-a：EGFP）斑馬魚(yú)交配的后代經(jīng)歷熱休克后，在熒光顯微鏡下根據(jù)心臟有無(wú)綠色熒光蛋白的引導(dǎo)表達(dá)，分成野生型（A，WT）與轉(zhuǎn)基因型［B，Tg（phsp：midkine-a：EGFP）］兩組。A，B為胚胎整體圖；A’，B’為心臟細(xì)節(jié)圖。白色箭頭指向表達(dá)綠色熒光蛋白的心臟。C、D，野生型與Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎在熱休克處理后的心臟DIC圖像。心房用紅色線描出，心室用白色線描出。圖4 熱休克引導(dǎo)midkine-a：EGFP在Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致胚胎心臟變?。ㄉ蠄D×100，下圖×20）Note.Heatshock treatments induce midkine-a：EGFP protein expression in the whole embryos.Wild-type and heterozygous Tg（phsp：midkine-a：EGFP）fish were crossed to get the wild-type（A）and Tg（phsp：midkine-a：EGFP）（B）embryos，and then these embryoswere heatshcocked to induce the transgene expression.A，B，whole embryos expressingmidkine-a：EGFP；A’，B’，the corresponding hearts expressingmidkine-a：EGFP.White arrow points to the green heart.C，D，DIC images of the wild-type and Tg（phsp：midkine-a：EGFP）hearts.The atriums were outlined by red color and the ventricles were outlined by white color.Fig.4 Heat shock treatment induces the expression of the fusion protein midkine-a：EGFP in Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos，leading to a small heart

2.4 斑馬魚(yú)胚胎過(guò)表達(dá)m idkine-a導(dǎo)致心肌細(xì)胞總數(shù)減少

如前（材料與方法）所述，我們將轉(zhuǎn)基因魚(yú)Tg（phsp：midkine-a：EGFP）與Tg（pcm lc2：dsRed-nuc）交配，得到并分離基因型為T(mén)g（phsp：midkine-a：EGFP）/Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）雜合子胚胎。先用熱休克處理誘導(dǎo)midkine-a的過(guò)表達(dá)，而后按照材料與方法所述在熒光顯微鏡下計(jì)算每個(gè)雜合子胚胎心臟的心肌細(xì)胞總數(shù)，與對(duì)照組相比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在熱休克處理之前1 h，過(guò)表達(dá)midkine-a組與對(duì)照組的心肌細(xì)胞總數(shù)相比較沒(méi)有區(qū)別；而在熱休克處理之后的72 hpf時(shí)，過(guò)表達(dá)組心肌細(xì)胞總數(shù)明顯減少至每個(gè)心臟平均126個(gè)心肌細(xì)胞。相反的是對(duì)照組的心肌細(xì)胞總數(shù)在這一時(shí)刻有約218個(gè)心肌細(xì)胞（圖7）。兩者之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。這說(shuō)明，與表型一致的是，過(guò)表達(dá)midkine-a導(dǎo)致心臟內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)減少，且這一現(xiàn)象與過(guò)表達(dá)midkine-a胚胎的小心臟表型密切相關(guān)。這說(shuō)明很可能midkine-a過(guò)表達(dá)阻礙了胚胎心肌細(xì)胞增殖，使其心肌細(xì)胞總數(shù)減少，導(dǎo)致小心臟的表型。

注：注射過(guò)對(duì)照MO（左）及midkine-MO（右）的胚胎的心臟DIC圖像。圖中箭頭指向心臟位置。攝像拍于胚胎82 hpf時(shí)。圖5 MO敲除midkine-a不影響胚胎心臟正常發(fā)育（×20）Note.DIC images of the embryonic control heart（Left）and the heart ofmidkine-a Knock-down embryos（Right）with morpholino. Black arrows point to the hearts.Fig.5 Knock-down ofmidkine-a withmorpholino does not affect the embryonic heart development

注：體外翻譯實(shí)驗(yàn)證實(shí)midkine-a嗎啉寡合核苷酸阻礙midkine-a cDNA翻譯作用的有效性及特異性。midkine cDNA體外翻譯實(shí)驗(yàn)用35S-甲硫氨酸標(biāo)記。為決定midkine-a嗎啉寡合核苷酸的有效性，midkine-a cDNA體外翻譯實(shí)驗(yàn)在無(wú)嗎啉寡合核苷酸（1道）、有對(duì)照嗎啉寡合核苷酸（2道）及有midkine-a嗎啉寡合核苷酸（3道）存在的條件下進(jìn)行。為決定midkine-a嗎啉寡合核苷酸的特異性，midkine-b cDNA體外翻譯實(shí)驗(yàn)在有對(duì)照嗎啉寡合核苷酸（4道）或有midkine-a嗎啉寡合核苷酸（5道）存在的條件下進(jìn)行。圖6 midkine-a嗎啉寡合核苷酸對(duì)斑馬魚(yú)midkine-a cDNA體外翻譯阻礙作用的有效性與特異性Note.In vitro translation using35S-methionine label shows the effectiveness and specificity ofmidkine-a MO.To determine the effectiveness ofmidkine-a MO，midkine-a cDNA in vitro translation experimentswere conducted in the absence（Lane 1），presence of control MO（Lane 2），and the presence ofmidkine-a MO（Lane3）.To determine the specificity ofmidkine-a MO，midkine-b cDNA in vitro translation experiments were conducted in the presence of control MO（Lane 4），and the presence ofmidkine-a MO（Lane 5）.Fig.6 The specificity and effectiveness ofmidkine-a MO on blocking the in vitro translation ofmidkine-a and midkine-b cDNA

3 討論

Midkine是一種可溶性細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能與小分子肝素結(jié)合，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及存活方面起著重要的多樣化的作用［1，13］。它是一個(gè)13 ×103的分泌分子，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域能與肝素結(jié)合，N端結(jié)構(gòu)域能與受體結(jié)合，兩個(gè)域之間以雙硫鍵相連［1，13］。它廣泛地表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤組織及心臟等器官或組織內(nèi)［13，14］。midkine能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂、存活、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨藥現(xiàn)象發(fā)生等［13，14］。盡管midkine也表達(dá)于胚胎及成年哺乳動(dòng)物心臟，但它在心臟中的功能人們還知之甚少。

注：雜合子魚(yú)系Tg（phsp：midkine-a：EGFP）與純合子魚(yú)系Tg（cmlc2：dsRed-nuc）交配，后代胚胎經(jīng)熱休克后，在72 hpf時(shí)根據(jù)心臟綠色熒光的有無(wú)分兩組，野生型（A）和midkine-a過(guò)表達(dá)組（B）。在熒光顯微鏡下兩組72 hpf胚胎的發(fā)紅色熒光的心肌細(xì)胞被計(jì)數(shù)。C圖所顯示的數(shù)目來(lái)自野生型和midkine-a過(guò)表達(dá)組各三組，每組平均3只胚胎的統(tǒng)計(jì)。*表明差異有顯著性，P＜0.05。圖7 過(guò)表達(dá)midkine-a組的胚胎心臟內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)比對(duì)照組低（×50）Note.The heterozygous（phsp：midkine-a：EGFP）fish was crossed with homozygous（cmlc2：dsRed-nuc）fish.Their progenies were heat-shocked and grouped into wild-type（A）and midkine overexpression（B）groups by the absence and presence of green fluorescence in the heart.To count their cardiomyocytes，the embryonic heartswere imaged with the red fluorescence undermicroscope at72 hpf.The experimentswere repeated three times and three embryoswere counted each time to get the average number of the cardiomyocytes in each group.*shows a significant statistical difference between the numbers of cardiomyocytes in the wild type and midkine-a overexpression groups.Fig.7 Overexpression ofmidkine-a leads to a reduced total number of cardiomyocytes in the embryonic heart

斑馬魚(yú)的midkine存在兩種亞型：midkine-a和midkine-b［3］。二者在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)形成的過(guò)程中起著重要的作用。在斑馬魚(yú)胚胎時(shí)期，midkine-a和midkine-b各自表達(dá)于獨(dú)立的互不重疊的區(qū)域［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道表明，midkine-a首先表達(dá)于原腸胚晚期的胚胎。當(dāng)神經(jīng)胚開(kāi)始形成時(shí)，midkine-a開(kāi)始出現(xiàn)在未分節(jié)的延髓傍中胚層［3］。而后，midkine-a以波浪式的方式從前至后表達(dá)于這一區(qū)域。在后期，midkine-a表達(dá)于軸旁中胚層及前神經(jīng)龍骨［3］。此時(shí)midekine-a的表達(dá)區(qū)域標(biāo)定了無(wú)midkine-a表達(dá)的內(nèi)側(cè)底板。midkine-a的表達(dá)在時(shí)間和空間上與內(nèi)側(cè)底板的出現(xiàn)一致［3］。在斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)，過(guò)表達(dá)midkine-amRNA可致內(nèi)側(cè)底板增大和其細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而嗎啉寡核苷酸敲除midkine-a可致內(nèi)側(cè)底板發(fā)育異常及其標(biāo)記物表達(dá)的缺失［3］。內(nèi)側(cè)底板與脊索臨近，且均由中線前體細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。該研究表明midkine-a可削弱脊索的發(fā)育，而內(nèi)側(cè)底板的增大是以脊索發(fā)育的減弱為代價(jià)，故而midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細(xì)胞命運(yùn)上起著重要的作用［3］。midkine在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的作用多樣化，并不單獨(dú)依賴于midkine作為生長(zhǎng)因子的作用。雖然midkine-a是一種生長(zhǎng)因子，BrdU摻入法及抗磷酸化組蛋白的免疫組化實(shí)驗(yàn)均表明底板細(xì)胞數(shù)目的增加并不來(lái)源于細(xì)胞增殖。故而midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細(xì)胞命運(yùn)上的作用與其自身作為生長(zhǎng)因子的作用無(wú)關(guān)［3］。我們的實(shí)驗(yàn)表明Mdikine-a也表達(dá)在胚胎心臟內(nèi)。在胚胎內(nèi)過(guò)表達(dá)Mdikine-a能阻礙心臟生長(zhǎng)。故而我們提出假說(shuō)，即類(lèi)似于midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細(xì)胞命運(yùn)的功能相似，過(guò)表達(dá)midkine-a阻礙胚胎心臟發(fā)育的機(jī)制也可能是其通過(guò)特化正常心肌細(xì)胞的命運(yùn)，限制心肌細(xì)胞總數(shù)，使得心肌細(xì)胞總數(shù)減少。早期的胚胎心臟生長(zhǎng)依賴于心肌細(xì)胞總數(shù)的增加，而過(guò)量的midkine-a可能通過(guò)阻礙心前細(xì)胞分化或阻礙心肌細(xì)胞增殖這兩種方式，降低心臟內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)。而嗎啉寡合核苷酸敲除midkine-a對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎心臟發(fā)育無(wú)影響，說(shuō)明midkine-a對(duì)心臟發(fā)育不是必需的，而過(guò)多的midkine-a則能起著限制性的作用?？傊琺idkine-a在斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育早期起著通過(guò)限制心肌細(xì)胞總數(shù)的方式以特化心肌細(xì)胞的命運(yùn)的作用。本研究的意義在于它將是將來(lái)進(jìn)一步研究midkine在心臟中的下游信號(hào)通路的基礎(chǔ)，并提供人們對(duì)心肌損傷后的心臟分子內(nèi)環(huán)境進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，為成人心肌缺血或梗死的可能的分子生物學(xué)治療奠定基礎(chǔ)［15］。

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M idkine-a inhibits zebrafish embryonic heart grow th by lim iting the cardiom yocyte pool

CHEN Jing1，LUO Jing2，Hitchcock Peter2
（1.Fujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350117，China；2.Kellogg Eye Center of University of Michigan-Ann Arbor，Ann Arbor，US 48103）

ObjectiveTo investigate the functional role of a soluble secretion factormidkine-a in the process of zebrafish embryonic heart development.M ethodsWhole-mount in situ hybridization was performed to detect whether midkine-a is expressed in the embryonic heart.In the transgenic embryonic heart of Tg（pmidkine-a：EGFP），the expression of EGFP in the heartwasmonitored.Multiple heat shock treatmentswere applied to Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos in order to overexpressmidkine-a，and the phenotype of the heart was observed.The heterozygous Tg（phsp：midkine-a：EGFP）fish were crossed with homozygous Tg（pcm lc2：dsRed）fish，which specifically expresses RFP in the nucleoli of embryonic cardiomyocytes to facilitatemyocyte number counting.To get Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）embryos，and the total number of cardiomyocytes in their heartwas counted and compared with the controls when the heat shock induced overexpression ofmidkine-a.Morphonino knocked out ofmidkine-a was performed to observe the heart phenotype.ResultsMidkine-a was expressed in the zebrafish embryonic heart during development.Overexpression ofmidkine-a led to a smaller heart and reduced total number of cardiomyoctes in a single heart，which might be associated with the smaller heart phenotype.Morphonilo knocked out ofmidkine-a had no effect upon the heart development.ConclusionsMidkine-a impedes zebrafish embryonic heart growth by limiting its cardiomyocyte pool.

Zebrafish embryo；Heart development；midkine-a；Cardiomyocyte pool

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0458-08

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.004

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.30971106）；福建省自然科學(xué)基金（No.2014J01304）；教育部留學(xué)回國(guó)人員基金（教外司留【2010】1561號(hào)）。

陳靜（1972ˉ），女，副教授，博士，研究方向：斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育。.E-mail：jc2417@fjnu.edu.cn