子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)小鼠生育能力的影響

崔陽陽，孫偉偉，趙瑞華*，徐彩，吳天思，2

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

研究報(bào)告

子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)小鼠生育能力的影響

崔陽陽1，孫偉偉1，趙瑞華1*，徐彩1，吳天思1，2

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

目的建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，觀察子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)模型小鼠妊娠能力的影響。方法通過“腹腔+皮下”同系異體子宮內(nèi)膜注射法建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，與假手術(shù)組、空白組比較，觀察其妊娠率及活胎率，觀察子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)模型小鼠妊娠能力的影響。結(jié)果建模2周后，小鼠皮下和腹腔均見有子宮內(nèi)膜異位病灶生成，模型組、假手術(shù)組和空白組，共三組。通過生育功能檢測(cè)，三組妊娠率差異有顯著性意義（P＜0.05）。三組的活胎數(shù)差異有顯著性意義（P＜0.05）。結(jié)論成功建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，并證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥可影響模型小鼠生育功能。

子宮內(nèi)膜異位癥；小鼠；生育功能

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM），是一種常見的雌激素依賴性疾病，是育齡婦女最常見的疾病之一，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥。內(nèi)異癥患者并發(fā)不孕高達(dá)40%～60%，而在不孕癥患者中也有40%～50%存在子宮內(nèi)膜異位癥［1］，內(nèi)異癥患者不孕為非內(nèi)異癥人群的20倍［2］?？梢?，內(nèi)異癥與不孕癥存在緊密聯(lián)系。2000年Buyalos等［3］首次提出“內(nèi)異癥相關(guān)不孕”。本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，在前期工作的基礎(chǔ)上，通過建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，探討EM對(duì)小鼠妊娠能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雌性，7周齡，體重（25±3）g，40只，雄性，10周齡，體重（33±2）g，10只。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2009-0007】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK（京）2009-0034】，燈光（12L：12D），室溫22℃。飼養(yǎng)動(dòng)物所需的籠具及飲水瓶均由專業(yè)飼養(yǎng)人員高壓滅菌后提供。雌性KM小鼠用于模型小鼠的供體、受體及空白對(duì)照，雄性KM小鼠用于與雌鼠合籠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

苯甲酸雌二醇購自寧波第二激素廠（中國，浙江，批號(hào)：110252511）。HE染色由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。其余所有的實(shí)驗(yàn)藥物及試劑均來自于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院免疫實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的建立［4］

模型建立前，選擇動(dòng)情周期正常的小鼠［5］作為模型小鼠的內(nèi)膜的供體以備移植注射，供體小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇（E2）促進(jìn)內(nèi)膜生長(zhǎng)并且使內(nèi)膜易于剝離。模型建立的實(shí)驗(yàn)過程皆在無菌條件下進(jìn)行操作。

脫頸處死供體小鼠，常規(guī)消毒后小鼠腹部并做一5 cm的切口暴露子宮，剪下子宮將其置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中（含100 U/mL青霉素，100 U/ mL鏈霉素）。用鹽水沖洗子宮，盡可能去除子宮上附著的多余脂肪組織、血塊及雜質(zhì)，使用“滾針法”細(xì)心剝離子宮內(nèi)膜［6］。將完整的管狀子宮內(nèi)膜縱形剖開，剪成1 mm×1 mm的小碎片以備注射使用（如圖1）。

受體小鼠以0.9%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹部常規(guī)消毒備用，將以16號(hào)針頭吸取0.2 mL的子宮內(nèi)膜碎片懸液（含4～8個(gè)小碎片）分別進(jìn)行腹腔注射與皮下注射［7ˉ8］。次日，小鼠皮下注射0.02 mL E2（1 mg/mL），促進(jìn)接種內(nèi)膜生長(zhǎng)，以5 d為一周期，持續(xù)3個(gè)周期。每日腹腔注射青霉素1萬單位，連續(xù)5 d以預(yù)防感染。假手術(shù)組給予注射等量生理鹽水?？瞻捉M不給予任何處理。所有小鼠注射的傷口恢復(fù)良好，體征正常，無不良反應(yīng)。模型建立的操作由第一作者完成。

1.2.2 子宮內(nèi)膜異位癥KM小鼠模型異位病灶取材及標(biāo)本處理

子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的異位病灶于2.4實(shí)驗(yàn)步驟處死小鼠時(shí)同步取材［4］。將取出的異位病灶用生理鹽水沖洗干凈，去除多余的脂肪組織和血塊后，將標(biāo)本置于4%中性甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。HE染色的操作人員不被告知實(shí)驗(yàn)組別。于倒置顯微鏡下觀察異位內(nèi)膜的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)。

1.2.3 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠成模判斷標(biāo)準(zhǔn)

子宮內(nèi)膜異位癥小鼠建模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)EMs的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］而定，鏡下出現(xiàn)子宮內(nèi)膜，腺體或腺體樣結(jié)構(gòu)，間質(zhì)和出血這4種改變的2種可判斷模型建立成功。

1.2.4 子宮內(nèi)膜異位癥KM小鼠模型妊娠能力的觀察

建模2周后，將三組雌鼠分別與以2∶1與性成熟雄鼠合籠，次日清晨見陰栓者視為交配成功，定為妊娠第1天。于合籠后第7天處死小鼠，觀察妊娠率及活胎數(shù)，其判斷標(biāo)準(zhǔn)［10］如下：妊娠率：妊娠率=妊娠只數(shù)/見栓只數(shù)；活胎：妊娠7d，孕體鮮明，判為存活；活胎率：活胎率=活胎數(shù)/總胎數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型異位病灶觀察

建模2周后，模型小鼠腹部皮下手可觸及米粒大小的結(jié)節(jié)，活動(dòng)度較好。子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型［4］的觀察結(jié)果如下（如圖2ˉ6）：小鼠皮下病灶，多為紅色、白色或暗紅色的米粒大小的結(jié)節(jié)；小鼠腹腔內(nèi)病灶，多為隆起囊泡或結(jié)節(jié)，囊泡內(nèi)充滿淡黃色清亮透明或混濁粘稠液體。皮下和腹腔內(nèi)病灶表面皆有血管網(wǎng)覆蓋并清晰可見。肉眼觀察下，在模型小鼠皮下和腹腔均可見病灶生成，小鼠皮下及腹腔有不同程度的粘連，而腹腔內(nèi)粘連較嚴(yán)重。通過病灶的HE染色可見：切片中可見有血管生成，并有大量腺體和間質(zhì)存在。本次建模共14只小鼠，僅1只未在腹腔及皮下找到病灶，僅見腹腔及皮下粘連，成功建模13只，可見，子宮內(nèi)膜異位癥小鼠“腹腔+皮下”注射法建立模型的成功率達(dá)90%以上。

圖2 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型皮下內(nèi)異位癥灶Fig.2 Ectopic lesions of endometriosis in the subcutaneous tissue in themodelmice

圖3 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型腹腔內(nèi)異位癥灶Fig.3 Ectopic lesions of endometriosis in the abdominal cavity ofmodelmice

2.2 子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠妊娠率及活胎數(shù)

采用Fisher精切概率法，三組妊娠率差異有顯著意義（P＜0.05）。通過兩兩比較，模型組妊娠率明顯低于假手術(shù)組與空白組（P＜0.05）；而假手術(shù)組與空白組的妊娠率差異無顯著性（P＞0.05）（見表1）。

采用非參數(shù)檢驗(yàn)，三組的活胎數(shù)差異有顯著性（P＜0.05）。通過兩兩比較，模型組的活胎數(shù)明顯低于假手術(shù)組與空白組（P＜0.05），而假手術(shù)組與空白組的活胎數(shù)差異無顯著性（P＞0.05）（見表2）。

注：A：正常子宮內(nèi)膜；B：異位子宮內(nèi)膜；C：異位子宮內(nèi)膜圖4 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型腹腔內(nèi)異位癥灶（標(biāo)尺=300μm）Note.A：Normal endometrium；B：Ectopic endometrium；C：Ectopic endometriumFig.4 Ectopic endometriotic lesions in the abdominal cavity ofmodelmice.Bar=300μm.

圖5 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型異位癥灶（標(biāo)尺=100μm）Fig.5 Ectopic endometriotic lesions in themodelmice.Bar=100μm.

注：A正常內(nèi)膜（標(biāo)尺=50μm）；B異位內(nèi)膜（標(biāo)尺=25μm）圖6 正常內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型異位內(nèi)膜Note.A：Normal endometrium（Bar=50μm）；B：Ectopic endometrium（Bar=25μm.）Fig.6 Normal endometrium（A）and ectopic endometriotic lesions（B）in themodelmice.

表1 三組妊娠率比較Tab.1 Comparison of pregnancy rates in the three groups

表2 各組活胎數(shù)比較Tab.2 Comparison of live embryo number in the three groups

3 討論

內(nèi)異癥是一種常見的、多發(fā)的良性婦科疾病，具有侵襲性和復(fù)發(fā)性。子宮內(nèi)膜異位癥的最佳診斷方法為腹腔鏡檢查，而腹腔鏡是有創(chuàng)性的檢查。內(nèi)異癥這種疾病僅自發(fā)于人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因此，關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的研究受到實(shí)際操作和倫理道德因素的限制而無法對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者進(jìn)反復(fù)進(jìn)行創(chuàng)傷性檢查，或進(jìn)行具有侵襲性的EM對(duì)照試驗(yàn)研究。因此，動(dòng)物模型則成為研究該內(nèi)異癥的一個(gè)主要方式及重要手段。目前，國內(nèi)外EM動(dòng)物模型在狒狒、猴、巴馬香豬、兔、大鼠和小鼠等動(dòng)物中都已有研究和發(fā)展。其中以兔和鼠最為常用，自發(fā)性EM動(dòng)物模型以有月經(jīng)周期的靈長(zhǎng)類動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但因發(fā)病率低且代價(jià)昂貴而限制了在EM模型中的應(yīng)用。誘發(fā)性EM動(dòng)物模型以子宮內(nèi)膜不發(fā)生脫落的動(dòng)情動(dòng)物為主，如：兔、鼠等。現(xiàn)有的模型大多是以自體移植誘導(dǎo)模型為主，移植方法是將動(dòng)物自體的子宮內(nèi)膜縫合到其腹膜、子宮系膜或腸系膜上，此法雖然能形成病灶且生長(zhǎng)良好，但病灶深藏于動(dòng)物腹腔體內(nèi)，須進(jìn)行二次手術(shù)進(jìn)行探查。此法建立的動(dòng)物模型不能保留完整子宮，限制了子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)于子宮內(nèi)膜、妊娠、胚胎方面的研究。為了減少動(dòng)物內(nèi)膜和人類內(nèi)膜存在的種屬和生化方面的差異，研究者故將免疫缺陷的裸鼠和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，其模型建立方法是將人類的子宮內(nèi)膜移植于小鼠腹腔［11，12］或皮下［13］，模型成功率可高達(dá)100%。但裸鼠價(jià)格較高，且免疫缺陷小鼠不能用于免疫方面的研究。馬麗等實(shí)驗(yàn)研究根據(jù)可靠的組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，免疫功能正常的ICR小鼠模型建立成功率可達(dá)83.3%，小鼠在價(jià)格和免疫學(xué)［14］研究應(yīng)用方面很大的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)于大鼠和兔模型，小鼠模型在某些方面有極大優(yōu)勢(shì)。如小鼠對(duì)E2的敏感性要超過大鼠等。

本實(shí)驗(yàn)選用KM小鼠，因其動(dòng)情周期短而規(guī)律、性成熟早、繁殖力強(qiáng)、生存及適應(yīng)能力強(qiáng)，免疫功能正常，價(jià)格適宜。通過“腹腔+皮下”同種異體子宮內(nèi)膜注射法建立EM小鼠模型。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組的妊娠率和活胎數(shù)與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），這表明小鼠的妊娠功能并未受到“腹腔+皮下”內(nèi)膜注射法整個(gè)操作過程的影響。而利用此方法建立模型較傳統(tǒng)開腹自體移植等造模方法相比，對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷小，可在一定程度避免腹腔手術(shù)操作、線結(jié)異物刺激對(duì)盆腔微環(huán)境可能產(chǎn)生的影響，減少動(dòng)物感染、死亡的發(fā)生。同時(shí)“皮下+腹腔”的疊加方法，不僅有利于觀察異位病灶的生長(zhǎng)帶來方便，避免二次開腹探查，而且也不會(huì)脫離腹腔環(huán)境，使異位病灶依附于腹腔微環(huán)境之中。采用該方法建立的EM小鼠模型異位病灶肉眼可見，形態(tài)典型、易觀察，病灶生長(zhǎng)部位分散且易見粘連帶，符合人類內(nèi)異癥的發(fā)病特征。經(jīng)HE染色的病理組織學(xué)驗(yàn)證，其造模成功率可達(dá)90%以上，故以“腹腔+皮下”同種異體子宮內(nèi)膜注射法建立EM KM小鼠模型是一種較優(yōu)的動(dòng)物模型。

本研究結(jié)果顯示，模型組的妊娠率、活胎數(shù)均明顯低于假手術(shù)組和空白組（P＜0.05），假手術(shù)組的妊娠率和活胎數(shù)與空白組比較無明顯差異（P＞0.05），這表明從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證，內(nèi)異癥可降低小鼠的妊娠功能，通過本實(shí)驗(yàn)造模方法所建立的EM小鼠模型，既保留了小鼠的完整雙子宮，又保持較強(qiáng)的生命活力，這與傳統(tǒng)自體移植建模方法相比，該模型更適用于子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕、生育能力、妊娠、輔助生殖及后續(xù)程序繁瑣等實(shí)驗(yàn)研究，可作為內(nèi)異癥相關(guān)不孕研究的理想動(dòng)物模型，為子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕的基礎(chǔ)研究提供了良好的研究手段和對(duì)象。

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Fffects of endometriosis on the reproductive ability ofm ice

CUIYang-yang1.2，SUNWei-wei1，ZHAO Rui-hua1*，XU Cai1，WU Tian-si1，2
（1.Department of Gynecology，Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China；2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029）

ObjectivesThe aim of the study was to establish amousemodel of endometriosis，and to observe the effects of endometriosis on the reproductive ability in themice.M ethodsThemousemodels of endometriosiswas established by subcutaneous and intraperitoneal injection of heterogenous endometrium.The pregnancy rate and live embryo number in the experimental，sham operation and blank groupswere observed and compared，and the effects of endometriosis on reproductive ability of themice were evaluated.ResultsTwo weeks after the establishment of the mouse model of endometriosis，there were lesions in the peritoneal cavity and subcutaneous tissue of the mice.Compared the pregnancy rates among themodel group，sham operation group and blank group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Compared the live embryo number in the three groups，there were also significant differences（P＜0.05）.ConclusionsA mousemodel of endometriosis is successfully established，and it demonstrates that endometriosismay affect the reproductive ability ofmice.

Endometriosis；Mouse；Reproductive ability

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0479-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.007

2015-05-05

國家自然科學(xué)基金（No：81173297）。

崔陽陽（1987年ˉ），女，碩士，專業(yè)：中醫(yī)婦科學(xué)。Tel：18810465649，E-mail：cuiyang870216@163.com

趙瑞華，女，博士生導(dǎo)師，研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥、月經(jīng)失調(diào)方向。Tel：010-88001139，E-mail：rhzh801@126.com