血管性癡呆患者p38MAPK通路變化及參茸養(yǎng)心益腎膠囊干預(yù)作用

石海濤 張傳領(lǐng)

血管性癡呆患者p38MAPK通路變化及參茸養(yǎng)心益腎膠囊干預(yù)作用

石海濤 張傳領(lǐng)

目的 觀察參茸養(yǎng)心益腎膠囊對(duì)血管性癡呆（AD）患者腦脊液和外周血p38MAPK通路主要因子P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)的影響。方法 血管性癡呆患者31例為病例組，給予參茸養(yǎng)心益腎膠囊治療，對(duì)比治療前后簡(jiǎn)易智能量表（MMSE）評(píng)分和長(zhǎng)谷川癡呆量表（HDS）評(píng)分變化；治療前后以Western blot檢測(cè)患者腦脊液和空腹靜脈血P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)量。以同期入院的26例非癡呆患者為對(duì)照組，進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 病例組治療前MMSE、HDS評(píng)分分別為（21.3±3.5）分、（19.6±3.4）分，治療后分別上升至（28.2±4.8）分、（24.3±4.2）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療前病例組腦脊液、血P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平為（0.983±0.106）、（0.867± 0.113），明顯高于對(duì)照組的（0.248±0.042）及（0.336±0.146）（P＜0.01）；治療后病例組P-p38MAPK蛋白表達(dá)量明顯降低，P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平顯著低于治療前（P＜0.05）。結(jié)論 參茸養(yǎng)心益腎膠囊可能通過(guò)抑制血管性癡呆患者p38MAPK磷酸化激活，干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)而獲得臨床療效。

血管性癡呆；p38MAPK通路；益腎活血；參茸養(yǎng)心益腎膠囊

血管性癡呆（vascular dementia，VD）泛指由腦血管因素而導(dǎo)致的腦組織損害和智能障礙，臨床以記憶、認(rèn)知、邏輯思維等精神功能衰退為主要表現(xiàn)，多發(fā)于老年人。研究[1-2]表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管性疾病的始動(dòng)因素，而且其病理學(xué)機(jī)制貫穿于血管性疾病的發(fā)病全程。自p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）通路與機(jī)體內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的關(guān)系被揭示以來(lái)，其生理學(xué)功能在VD發(fā)病過(guò)程中的介導(dǎo)作用受到重視。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3-4]也已經(jīng)證實(shí)，VD大鼠、小鼠的海馬p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，且其含量變化與模型鼠的記憶能力密切相關(guān)。本研究觀察31例VD患者的腦脊液和外周血p38MAPK通路活化狀態(tài)及中成藥參茸養(yǎng)心益腎膠囊對(duì)該通路的調(diào)控作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年2月—2013年6月本院神經(jīng)內(nèi)科收治老年VD患者31例為病例組，男19例，女12例；年齡56～81歲，平均（71.3±6.3）歲；病程1～11年，平均（5.3±0.7）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合田金洲2000版中醫(yī)辨證量表診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn)[5]；②同時(shí)符合NINDS-ADRDA診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③MMSE＜27分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①假性抑郁性癡呆或重度癡呆；②神經(jīng)精神類(lèi)疾病；③癲癇；④帕金森氏?。虎菽[瘤或癌癥；⑥免疫、血液系統(tǒng)疾病；⑦機(jī)體重要器官器質(zhì)性損傷等。另以同期收治的非癡呆患者26例為對(duì)照組，其中男15例，女11例；年齡55～78歲，平均（70.6±5.7）歲；慢性阻塞性肺病5例，高血壓7例,冠心病14例。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器和試劑 高速低溫離心機(jī)（CTechcomp，T15RT）；蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置（SDS-PAGE TY0736，美國(guó)伯樂(lè)公司）；振蕩培育箱（LRH-250-2，廣東醫(yī)療器械廠）；預(yù)染蛋白marker（26681，Pierce）；Tween20（P9416，Sigma）；一抗Anti-phospho-p38 MAPK（pThr 179+Tyr181）antibody（SAB4504095，Sigma）；一抗Anti-p38 MAPK antibody（SAB4500493，Sigma）；一抗Anti-actin antibody（A2066，Sigma）；二抗Anti-Rabbit IgG-Tracy 645（05557，Sigma）；其他Western blot常規(guī)試劑如RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TEMED、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液等均由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.3 研究方法 病例組入院后予參茸養(yǎng)心益腎膠囊（規(guī)格：0.4g/粒）1次4粒，1天3次。4周為1個(gè)療程，共治療2個(gè)療程，于治療前后取腦脊液和靜脈血。對(duì)照組于入院時(shí)取腦脊液和外周血。所得腦脊液和靜脈血以RIPA裂解液（含1.0%PMSF）抽提蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。濃度確立后配置為1μg/ μL的buffer液。以10μL為上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：80V 25min，100V 80min，使不同分子量的蛋白條帶分離。麗春紅染液檢測(cè)分離條帶清晰、完整，轉(zhuǎn)印至NC膜，轉(zhuǎn)印條件：100V 1h。轉(zhuǎn)印的NC膜先行一抗孵育，4℃震蕩搖勻過(guò)夜，P-p38 MAPK、p38 MAPK、β-actin均溶于4%的脫脂牛奶，抗體濃度分別為1:2500、1:2000、1：3000。PBS液清洗3～5次，二抗孵育，抗體濃度均為1: 2000，28℃ 90min。二抗孵育完畢進(jìn)行顯影，顯影條帶掃描成像，以灰度分析軟件分析灰度值，目的條帶和β-actin比值為最終相對(duì)表達(dá)量。

1.4 觀察指標(biāo) 病例組治療前后應(yīng)用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表（MMSE）、長(zhǎng)谷川癡呆量表（HDS）進(jìn)行評(píng)分[7]；兩組P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，治療前組間對(duì)比采用兩獨(dú)立分組t檢驗(yàn)，病例組治療前后采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后MMSE和HDS評(píng)分 病例組治療后MMSE和HDS評(píng)分均有所提高，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 VD患者治療前后MMSE和HDS評(píng)分比較（分，±s）

表1 VD患者治療前后MMSE和HDS評(píng)分比較（分，±s）

治療前治療后t，P 31 31 -21.3±3.5 28.2±4.8 6.221，0.000 19.6±3.4 24.3±4.2 4.652，0.000

2.2 兩組P-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)比較 治療前，病例組外周血、腦脊液P-p38MAPK蛋白表達(dá)量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；治療后病例組外周血、腦脊液P-p38MAPK蛋白表達(dá)量明顯降低，P-p38MAPK/ p38MAPK表達(dá)水平顯著低于治療前（P＜0.01）；見(jiàn)表2～3、圖1。

3 討論

VD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，內(nèi)皮系統(tǒng)損傷為其重要突破口之一。內(nèi)皮細(xì)胞激活是發(fā)生內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的始動(dòng)因素，炎癥介質(zhì)、應(yīng)激刺激、病原體感染、細(xì)菌內(nèi)毒素等病理因素均可構(gòu)成其激活條件，激活后又可持續(xù)釋放多種黏附分子、炎性介質(zhì)及活性物質(zhì)，誘發(fā)進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[7]。p38MAPK信號(hào)通路由一組以級(jí)聯(lián)方式依次活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，MAPK激酶激酶、MAPK激酶及MAPK通過(guò)磷酸化依次將上游信號(hào)傳遞至下游應(yīng)答分子，故而p38MAPK磷酸化為該通路活化的重要標(biāo)志之一，即P-p38MAPK為p38MAPK的活化狀態(tài)。劉倩等[8]對(duì)p38MAPK信號(hào)通路與內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的相關(guān)性做了闡述，指出p38MAPK通路活化是啟動(dòng)內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的先決條件，在血管性疾病中發(fā)揮了誘導(dǎo)、催化和促進(jìn)級(jí)聯(lián)化的病理功能。

表2 兩組腦脊液P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平（±s）

表2 兩組腦脊液P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平（±s）

注：“t1，P1”表示病例組治療前與對(duì)照組比較，“t2，P2”表示病例組治療前與治療后比較

組別對(duì)照組病例組治療前治療后例數(shù)26 31 31 t1，P1t2，P2--P-p38MAPK 0.135±0.084 0.517±0.121 0.246±0.095 14.02，0.000 9.471，0.000 p38MAPK 0.543±0.102 0.526±0.084 0.534±0.093 0.678，0.250 0.338，0.368 P-p38MAPK/p38MAPK 0.248±0.042 0.983±0.106 0.461±0.063 35.47，0.000 23.02，0.000

表3 兩組外周血P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平比較（±s）

表3 兩組外周血P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平比較（±s）

注：“t1，P1”表示病例組治療前與對(duì)照組比較，“t2，P2”表示病例組治療前與治療后比較

對(duì)照組病例組治療前治療后26 31 31 t1，P1t2，P2--0.203±0.146 0.465±0.187 0.312±0.162 6.639，0.000 4.543，0.000 0.554±0.281 0.536±0.275 0.549±0.277 0.243，0.404 0.177，0.430 0.336±0.146 0.867±0.113 0.568±0.185 11.12，0.000 5.672，0.000

圖1 病例組P-p38MAPK、p38MAPK表達(dá)W estern blot顯影圖像注：①A腦脊液，B外周血；②1、2對(duì)照組腦脊液，3、4病例組治療前腦脊液，5、6病例組治療后腦脊液

中藥治療VD的臨床療效已被諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9-10]，本研究中所用參茸養(yǎng)心益腎膠囊藥物組成為鹿茸、人參、酒制菟絲子、肉蓯蓉、何首烏、桑葚及黃精等，藥理研究[11-12]表明，鹿茸含有雄性激素、卵泡激素及多種微量元素，可改善能量代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，具有強(qiáng)筋骨、抗疲勞之效。適量的鹿茸還能夠增加心輸出量和血氧量、改善血液循環(huán)，同時(shí)提高副交感神經(jīng)的興奮性，促進(jìn)受損神經(jīng)功能恢復(fù)，是治療血管性疾病的良品。人參性溫，為中醫(yī)常用補(bǔ)益藥，具有擴(kuò)血管作用，可改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，提高學(xué)習(xí)記憶能力。方中鹿茸、人參共為君藥；菟絲子補(bǔ)肝腎、益精髓，肉蓯蓉與何首烏補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血，共為臣藥；桑葚既可入食，又可入藥，可養(yǎng)心益智、補(bǔ)血活血，為佐藥；黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾潤(rùn)肺，為佐使；諸藥合用，共司養(yǎng)血活血、益腎安心之效。本研究結(jié)果顯示，治療前病例組P-p38MAPK蛋白表達(dá)量偏高，P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；治療后，病例組P-p38MAPK蛋白表達(dá)量明顯降低，P-p38MAPK/p38MAPK表達(dá)水平顯著低于治療前，且病例組患者M(jìn)MSE、HDS評(píng)分亦有顯著提升，說(shuō)明老年VD患者的p38MAPK通路確實(shí)處于異常活化狀態(tài)，而益腎活血方藥可抑制其活化，提高患者認(rèn)知能力。

綜上所述，老年VD的發(fā)病過(guò)程中伴隨著p38 MAPK通路的活化，參茸養(yǎng)心益腎膠囊能夠通過(guò)下調(diào)P-p38MAPK水平抑制其活化過(guò)程，從而中斷p38MAPK信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可能為其治療VD的重要藥理機(jī)制之一。

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（收稿：2014-11-16 修回：2015-01-26）

p38MAPK Pathway Changes in Patients w ith Vascular Dementia and the Effect of Ginseng Nourishing the Heart and K idney CapsuleIntervention

SHI Haitao1,ZHANG Chuanling2. 1Department of Neurology,2Clinical Laboratory,Xiaoshan Hospital,Hangzhou(311201),China

Objective To investigate the effect of ginseng yangxin yishen capsule on P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood from patients with vascular dementia.M ethods Thirty-one patients with vascular dementia were recruited as case group and were given ginseng yangxin yishen capsules.Mino-mental State Examination（MMSE）and Hasegawa Dementia（HDS）scores were evaluated and compared before and after treatment.P-p38MAPK/p38MAPK protein expression in cerebrospinal fluid and peripheral blood were detected by Western blot.Twenty-six non-vascular dementia patients over the same period served as control.Results In case group,the MMSE and HDS scores increased to 28.2±4.82 and 24.3±4.19 from 21.3±3.54 and 19.6±3.44,respectively,both with significant difference before and after treatment（P＜0.05）.Before treatment, P-p38MAPK/p38MAPK protein expressions in cerebrospinal fluid and peripheral blood in case group were higher than those in control group（cerebrospinal:0.983±0.106 vs 0.248±0.042，P＜0.05;peripheral blood:0.867±0.113 vs 0.336±0.146,P＜0.05）;after treatment,the expression of P-p38MAPK protein and P-p38MAPK/p38MAPK level in case group significantly decreased compared with those before treatment（P＜0.05）.Conclusion Ginseng yangxin yisheng capsule may treat vascular dementia by interfering p38MAPK signal pathway via inhibiting activation of P-p38MAPK.

vascular dementia;p38MAPK signal pathway;yishen huoxue;Ginseng yangxin yisheng capsule

杭州市蕭山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（石海濤）、檢驗(yàn)科（張傳領(lǐng)）（杭州 311201）

石海濤，Tel：18967168116；E-mail：ll_141005@sina.com