槲皮素對人膠質(zhì)母細胞瘤T98G凋亡及HSP27蛋白表達的干預(yù)作用

陶曉薇毛其芬

槲皮素對人膠質(zhì)母細胞瘤T98G凋亡及HSP27蛋白表達的干預(yù)作用

陶曉薇1毛其芬2

目的 探討天然藥物槲皮素對人膠質(zhì)母細胞瘤的生物效應(yīng)及機制。方法 采用槲皮素治療人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系T98G，MTT法檢測治療后T98G細胞的增殖抑制情況；流式細胞術(shù)檢測槲皮素治療后T98G細胞的凋亡情況，并用Western blot檢測細胞活化caspase-3（cleaved caspase-3）的表達和熱休克蛋白27（HSP27）的表達；將T98G細胞的HSP27基因用特異性HSP27 siRNA沉默后再用槲皮素治療，檢測槲皮素對T98G細胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果 對照組及5μM、25μM、50μM、100μM、200μM槲皮素組對T98G細胞的48h增殖抑制率分別為0、（0.05± 0.02）%、（21.8±3.4）%、（42.2±5.7）%、（67.6±6.8）%、（76.9±7.0）%，各濃度槲皮素組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組及25μM、50μM、100μM槲皮素組對T98G細胞的凋亡誘導(dǎo)率分別為（0.8±0.3）%、（4.9±0.6）%、（8.1±0.9）%、（21.5±1.7）%，各濃度槲皮素組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組及25μM、50μM、100μM槲皮素組T98G細胞caspase-3活性分別為（0.01±0.01）、（0.05±0.03）、（0.12±0.03）、（0.22±0.05），50μM、100μM槲皮素組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HSP27活性分別為（0.84±0.12）、（0.75±0.11）、（0.52±0.08）、（0.37±0.06），50μM、100μM槲皮素組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 槲皮素有良好的抗神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的生物活性，其抗腫瘤機制可能和下調(diào)HSP27蛋白有關(guān)。

人膠質(zhì)母細胞瘤；槲皮素；T98G；HSP27；凋亡；caspase-3

神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦癌，惡性膠質(zhì)瘤細胞通過擴散、滲透入侵正常腦組織，使患者無法進行腫瘤組織全切除手術(shù)[1]。據(jù)統(tǒng)計，大多數(shù)被確診為神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的患者，盡管接受了包括手術(shù)、放療、化療等常規(guī)治療措施，其生存周期仍短于一年[2]，尋找新的治療方法無疑十分重要。和其它的一些惡性腫瘤相似，人腦癌細胞高度表達熱休克蛋白27（HSP27）[3]。HSP27的高度表達能顯著促進腫瘤細胞的增殖和分化，更為重要的是，HSP27蛋白能保護細胞逃避凋亡這一大多數(shù)抗腫瘤藥物的效應(yīng)靶點[4]。槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜、谷物中的天然黃酮類化合物,有很好的抗氧化和抗炎作用，近年研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能激活腫瘤細胞的凋亡通路，誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡[5]。槲皮素對腦癌的抗腫瘤效應(yīng)及其機制少見報道。本研究探討槲皮素對神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的抗腫瘤效應(yīng)及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤T98G細胞系來源于美國ATCC（產(chǎn)品號：CRL-1690），培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/ mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫，通入5%的CO2。

1.2 試 劑 DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司。槲皮素、二甲亞砜、噻唑藍（MTT）購于Sigma-Aldrich。PI/ AnnexinⅤ凋亡試劑盒購于美國ebioscience?；罨痗aspase-3抗體（cleaved caspase-3，該抗體只和活化caspase-3結(jié)合，不和非活化全長caspase-3結(jié)合，產(chǎn)品號：#9664），HSP27抗體（產(chǎn)品號：#2402）及βactin抗體（產(chǎn)品號：#4967）購于美國cell signaling公司。細胞蛋白裂解液購于碧云天公司。PVDF膜購于美國Millipore公司。HSP27 siRNA合成于廣州銳博生物有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。

1.3 MTT試驗 將T98G細胞按2000個/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個復(fù)孔，并分別予5、25、50、100和200μM的槲皮素培養(yǎng)24、48h，對照組為不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24、48h。加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞增殖抑制率計算公式：抑制率＝（OD對照組-OD槲皮素組）/OD對照組× 100%。

1.4 細胞凋亡試驗 T98G細胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測。在T98G細胞培養(yǎng)瓶中分別加入25、50、100μM的槲皮素培養(yǎng)24h，對照組不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24h，之后按照試劑說明書將PI和Annexin V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡。Annexin V單陽性細胞為早期凋亡細胞，Annexin V和PI雙陽性細胞為晚期凋亡[6]，因此細胞凋亡率用Annexin V陽性細胞占所有細胞比值表示。

1.5 Western blot試驗 在T98G細胞培養(yǎng)瓶中分別加入25、50和100μM的槲皮素培養(yǎng)24h，對照組為不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24h，收集細胞并裂解，裂解液用12.5%的丙烯酰胺進行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在HSP27一抗或cleaved caspase-3一抗稀釋液中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X線膠片，以HSP27或cleaved caspase-3蛋白條帶與β-actin蛋白條的灰度比值表示蛋白的相對表達水平。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染 將T98G細胞接種在6孔板中，待細胞密度生長到鋪滿板面約80%時按Lipofectamine 2000操作說明書在 T98G細胞中轉(zhuǎn)染 100nM的HSP27 siRNA或無關(guān)對照siRNA培養(yǎng)16h，之后加100μM的槲皮素再培養(yǎng)24h，檢測細胞增殖抑制率，凋亡水平和 cleaved caspase-3表達水平。HSP27 siRNA序列為：正向：5'-GAGUGGUCGCAGUGGUUAGUU-3'；反向：5'-CUAACCACUGCGACCACUCUU-3'。無關(guān)RNA序列為正向：5'-UGGGAGCAGUCG UAGUGGUUU-3'；反向：5'-CUCCCAACCACUGCGA CUAUU-3'

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤T98G的抑制作用

與對照組比較，T98G細胞在較小濃度槲皮素作用下即呈現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)（濃度≥25μM），隨著槲皮素劑量增加，抗腫瘤生長效應(yīng)逐漸增強，用槲皮素治療48h較24h抑制作用更加明顯，提示槲皮素對腫瘤細胞的殺傷作用隨著治療時間的增加而增強。見表1。

表1 不同濃度槲皮素對T98G細胞的抑制作用（±s）

表1 不同濃度槲皮素對T98G細胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同濃度槲皮素處理24h比較，△P＜0.05

組別對照組5μM槲皮素組25μM槲皮素組50μM槲皮素組100μM槲皮素組200μM槲皮素組孔數(shù) 槲皮素濃度（μM）3 3 3 3 3 3 0 5 2 5 50 100 200 24h抑制率（%）0 -0.04±0.03 14.5±2.1* 24.6±3.9* 45.3±5.6* 62.5±7.7* 48h抑制率（%）0 0.05±0.02 21.8±3.4*△42.2±5.7*△67.6±6.8*△76.9±7.0*△

表2 槲皮素下調(diào)HSP27表達并誘導(dǎo)T98G細胞凋亡（±s）

表2 槲皮素下調(diào)HSP27表達并誘導(dǎo)T98G細胞凋亡（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組25μM槲皮素組50μM槲皮素組100μM槲皮素組孔數(shù)3 3 3 3槲皮素濃度（μM）0 25 50 100凋亡率（%）0.8±0.3 4.9±0.6* 8.1±0.9* 21.5±1.7* cleaved caspase-3 /β-actin 0.01±0.01 0.05±0.03 0.12±0.03* 0.22±0.05* HSP27 /β-actin 0.84±0.12 0.75±0.11 0.52±0.08* 0.37±0.06*

表3 HSP27 siRNA對槲皮素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表3 HSP27 siRNA對槲皮素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與無關(guān)siRNA組比較，#P＜0.05

組別對照組無關(guān)siRNA組HSP27 siRNA組孔數(shù)HSP27 siRNA（nM）3 3 3 0 0 100無關(guān)siRNA（nM）100 100 0槲皮素濃度（μM）0 100 100 HSP27/β-actin 0.79±0.13 0.40±0.07* 0.15±0.04*#24h抑制率（%）0 42.5±5.7* 68.9±6.8*#凋亡率（%）0.9±0.3 22.4±1.9* 36.8±2.5*#cleaved caspase-3/β-actin 0.01±0.01 0.19±0.04* 0.31±0.07*#

2.2 槲皮素下調(diào)T98G細胞HSP27的表達并誘導(dǎo)細胞凋亡 T98G細胞用槲皮素治療后用Annexin V/PI染色法檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)槲皮素呈劑量依賴性誘導(dǎo)T98G細胞凋亡，見表2。Caspase-3是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵蛋白，當caspase-3被激活后，通過切斷多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）導(dǎo)致細胞進入凋亡程序[7]。Western blot試驗發(fā)現(xiàn)槲皮素治療使T98G細胞cleaved caspase-3水平顯著提高。HSP27的表達水平顯著降低，見表2。提示槲皮素可能通過下調(diào)HSP27的表達，誘導(dǎo)T98G細胞發(fā)生凋亡。

2.3 HSP27基因沉默增強槲皮素的抗腫瘤活性 利用基因沉默技術(shù)，將HSP27 siRNA或無關(guān)siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到T98G細胞中，之后將100μM槲皮素加入到細胞培養(yǎng)體系中，檢測HSP27基因沉默后槲皮素對T98G細胞生長的抑制效應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HSP27 siRNA可顯著降低HSP27的表達，增強槲皮素對T98G細胞生長的抑制作用。與轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA組比較，轉(zhuǎn)染HSP27 siRNA槲皮素對T98G細胞的凋亡誘導(dǎo)能力顯著增強，cleaved caspase-3表達水平大大提高，見表3。提示HSP27蛋白是神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤抵抗凋亡的關(guān)鍵分子，槲皮素可能通過下調(diào)腫瘤細胞HSP27的表達發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的特征之一是高表達熱休克蛋白，這可能是因為膠質(zhì)瘤細胞處于高度低氧和pH失衡狀態(tài)，熱休克蛋白的細胞保護作用是腫瘤存活不可缺少的重要機制[8]。在熱休克蛋白家族中，HSP27通過與凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，阻斷凋亡信號的傳導(dǎo)并抑制caspase的活化，從而對保護腫瘤細胞逃避凋亡起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[9]。此外，HSP27還能抑制前caspase-9和前caspase-3的表達，并抑制從線粒體中釋放的細胞色素C的活性來達到阻斷凋亡的目的[10]。槲皮素是一種天然黃酮素，具有良好的抗腫瘤活性能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，其機制包括打開腫瘤細胞線粒體膜孔道釋放細胞色素C，活化caspase-9和caspase-3等途徑[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素具有顯著的體外抗神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的生物效應(yīng)，誘導(dǎo)腦癌細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著下調(diào)熱休克蛋白27這一關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，這可能是槲皮素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制之一。當用HSP27 siRNA轉(zhuǎn)染T98G細胞使HSP27基因沉默后，槲皮素對T98G細胞的凋亡效應(yīng)和caspase-3的活化程度都顯著增強，這些結(jié)果都支持了槲皮素誘導(dǎo)T98G細胞凋亡依賴于HSP27的下調(diào)這一觀點。綜上所述，本研究結(jié)果顯示槲皮素有潛在的抗腦腫瘤的生物效應(yīng)，為腦腫瘤的藥物治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

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（收稿：2014-10-23 修回：2014-12-26）

Effect of Quercetin on Apoptosis in Glioblastoma Cell Line T98G and the Expression of HSP27 Protein

TAO Xiaowei1,MAO Qifeng2. 1Gongshu District Xiaohe Hushu Street Community Health Center,Hangzhou (310011),China;2Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect and mechanism of natural medicine quercetin on glioblastoma cells.M ethods T98G cells were treated with quercetin and the proliferation was measured by using the MTT assay.The apoptosis of T98G was measured by flow cytometry and the expression of cleaved caspase-3 and HSP27 in T98G cells treated with quercetin was detected by western blot.The specific siRNA transfected method was used for blocking the expression of HSP27 gene before T98G cells were treated with quercetin,then the proliferation and apoptosis were detected.Results The 48-hour proliferation inhibition rates of T98G cells in control group,5μM quercetin group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,100μM quercetin group,and 200μM quercetin group were 0,（0.05±0.02）%,（21.8±3.4）%,（42.2±5.7）%,（67.6±6.8）%,（76.9±7.0）%,respectively,with significant difference among them（P＜0.05）.The apoptosis rate of T98G cells in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were（0.8±0.3）%,（4.9±0.6）%,（8.1±0.9）%,（21.5±1.7）%, respectively,with significant difference among them（P＜0.05）;caspase-3 activity ratio in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were 0.01±0.01,0.05±0.03,0.12±0.03,and 0.22±0.05,with significant difference between control group and 50μM quercetin group and 100μM quercetin group（P＜0.05）;HSP27 inhibition ratio in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were 0.84±0.12,0.75±0.11,0.52±0.08,and 0.37±0.06,with significant difference between control group and 50μM quercetin group and 100μM quercetin group（P＜0.05）.Conclusion Quercetin has some anti-glioblastoma effect,and the underlying mechanism may be through down-regulating the expression of HSP27.

glioblastoma;quercetin;T98G;HSP27;apoptosis;caspase-3

1杭州市拱墅區(qū)小河湖墅街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗科（杭州 310011）；2浙江省立同德醫(yī)院檢驗科（杭州 310012）

陶曉薇，Tel：13777406008；E-mail：qongshutaoxiaowei@163.com