乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查方法的建立及驗證

劉 棟，湯長明，郝 哲（解放軍153中心醫(yī)院藥械科，河南 鄭州 450042）

·研究報告·

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查方法的建立及驗證

劉 棟，湯長明，郝 哲（解放軍153中心醫(yī)院藥械科，河南 鄭州 450042）

目的建立乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的無菌檢查方法。方法根據(jù)《中華人民共和國藥典（二部）》2010年版所列方法，通過增加沖洗液用量和加入中和劑，采用薄膜過濾法進行實驗研究。結(jié)果以0.1%蛋白胨水溶液作為沖洗液，每管沖洗液容量為700m l，每次沖洗100m l，金黃色葡萄球菌不能正常生長。然而，使用含中和劑的培養(yǎng)基時，沖洗量每管300m l，所有陽性對照菌均生長良好。結(jié)論本法簡單方便，適用于乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的無菌檢查。

乳酸左氧氟沙星；注射液；無菌檢查

左氧氟沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥，為氧氟沙星的左旋體，在臨床上廣泛用于G＋菌所致的呼吸道、泌尿道等部位的急、慢性感染［1］。乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液抗菌活性較強，根據(jù)《中華人民共和國藥典（二部）》2010年版所示方法［2］，采用增加沖洗液量和在培養(yǎng)基中加入中和劑，考察供試品的抗菌性能否在無菌檢查時得到有效消除。中和劑選用能與喹諾酮類藥物發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)［3，4］的Mg2＋和M n2＋［4-9］。本實驗按照《中華人民共和國藥典（二部）》2010年版附錄ⅪH“無菌檢查法”（以下簡稱：藥典“無菌檢查法”）中的原則性要求進行實驗，確定了乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查的具體條件。

1 儀器與試藥

1.1 實驗菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC（Ｂ） 26003］ 、大腸桿菌［CMCC（Ｂ） 44102］ 、枯草芽孢桿菌［CMCC（Ｂ）63501］ 、生孢梭菌［CMCC（Ｂ） 64941］ 、白色念珠菌［CMCC（Ｆ）98001］ 、黑曲霉［CMCC（Ｆ）98003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基、沖洗液、中和劑 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。氯化鎂（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）、硫酸錳（天津市化學(xué)試劑三廠）均為分析純。

含Mg2＋培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基配制過程中加入氯化鎂，Mg2＋在培養(yǎng)基中的終濃度為0.2mol／L。含Mn2＋培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基配制過程中加入5%的0.2mol／L硫酸錳。

所有培養(yǎng)基、沖洗液均按照藥典“無菌檢查法”項下要求配制及滅菌。

培養(yǎng)基的適用性檢查、無菌性檢查、靈敏度檢查根據(jù)《中華人民共和國藥典（二部）》2010年版附錄，檢查符合要求。

1.3 儀器 標準無菌室；全自動數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱；全自動數(shù)顯生化培養(yǎng)箱；全自動數(shù)顯立式蒸汽滅菌鍋；HTY-2000A型智能集菌儀、全封閉集菌培養(yǎng)器（孔徑0.22μm）等，由杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司提供。

1.4 樣品 乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（規(guī)格：0.5g／100m l，某院制劑，批號：1309161、1309162、1309163）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 將上述菌種按《中華人民共和國藥典（二部）》附錄“菌液制備方法”制成所需濃度的菌懸液及孢子懸液，備用。菌液制備結(jié)果見表1。

表1 菌落計數(shù)結(jié)果（cfu／ml）

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 方法學(xué)驗證Ⅰ 按照《中華人民共和國藥典（二部）》規(guī)定，將樣品9瓶全量通過全封閉三聯(lián)集菌培養(yǎng)器，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每次每管100m l，沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的實驗用菌。在各管中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，每管100m l。陽性對照組：另取集菌培養(yǎng)器，不過濾樣品，其他操作同上。陰性對照組：另取集菌培養(yǎng)器，過濾0.1%蛋白胨水溶液（用量同實驗組），分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各100m l。

以上所得培養(yǎng)基，按各菌種規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，結(jié)果見表2。

由表2可知，當沖洗液為300m l／管的0.1%蛋白胨水溶液時，陽性對照組各實驗菌均生長良好，陰性對照組均無菌落生長。而實驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均未正常生長，表明300m l／管的沖洗量不能消除樣品的抑菌活性。當沖洗量增加到500m l／管時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌仍不能生長。將沖洗量增加到700m l／管，金黃色葡萄球菌的生長狀況仍不如陽性對照組。若進一步增加沖洗量，勢必增加濾膜的負擔(dān)，也會對濾膜上的微生物造成危害。由此可見，需要探索一種更為有效、方便快捷的無菌檢查方法。

表2 方法學(xué)驗證結(jié)果（Ⅰ）

2.2.2 方法學(xué)驗證Ⅱ 操作方法同“2.2.1”項，其中，0.1%蛋白胨水溶液用量為300m l／管，最后加入100m l含Mg2＋培養(yǎng)基，各實驗菌同法操作。陽性對照組和陰性對照組使用的培養(yǎng)基均為含Mg2＋培養(yǎng)基。所得各培養(yǎng)基按各菌種規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。結(jié)果見表3。

表3 方法學(xué)驗證結(jié)果（Ⅱ）

由表3可知，培養(yǎng)基中加入Mg2＋后，在沖洗液量較少的情況下，實驗組與陽性對照組的各實驗菌均能良好生長，陰性對照組均無菌落生長，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或者抑菌作用不影響無菌檢查，上述方法可行。

2.2.3 方法學(xué)驗證Ⅲ 操作方法同上，但使用的培養(yǎng)基換作含M n2＋的培養(yǎng)基。實驗結(jié)果顯示，實驗組的各實驗菌生長良好，說明Mn2＋也能在該檢驗條件下消除樣品的抑菌作用。

預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)硫酸錳在培養(yǎng)基中溶解性較差，特別是在改良馬丁培養(yǎng)基中因用量稍大容易出現(xiàn)渾濁；另外，金黃色葡萄球菌在含Mn2＋硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)不如它在含Mg2＋的培養(yǎng)基中易于觀察。因而，乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的無菌檢查使用含Mg2＋的培養(yǎng)基更為合理。

2.3 樣品的無菌檢查 取本品9瓶，全量通過全封閉三聯(lián)集菌培養(yǎng)器，然后用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每次每管100m l，沖洗總量為每管300m l，最后在各管中分別加入相應(yīng)的含M g2＋的培養(yǎng)基，每管100m l。同時，分別做陽性對照和陰性對照。將各培養(yǎng)基置規(guī)定溫度培養(yǎng)14d，逐日觀察。結(jié)果顯示，供試品管和陰性對照管澄清，陽性對照管（金黃色葡萄球菌）則生長良好，表明供試品無菌檢查符合規(guī)定。

3 討論

方法學(xué)驗證Ⅰ參考了柏大為［10］和白麗娟［11］建立的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液無菌檢查方法，當沖洗量為300m l／管時，不能有效消除樣品的抗菌活性，原因或與樣品規(guī)格有關(guān)。兩人所用樣品規(guī)格為0.2g／100m l，而本實驗規(guī)格為0.5g／100m l，在濾膜和濾器上吸附的量必然要高些。這也與江志杰等［12］的觀點相同，其所用樣品為左氧氟沙星注射液（規(guī)格：0.75g／150m l），經(jīng)驗證需要加大沖洗液的用量，當加入中和劑組氨酸-卵磷脂-聚山梨酯80混合溶液時，沖洗液量大大降低。

方法學(xué)驗證Ⅱ預(yù)實驗考察了將中和劑加入沖洗液以消除樣品的抑菌性［13，14］，結(jié)果是沖洗量仍然很大，原因可能是沖洗液過濾速度較快，中和劑與樣品作用時間短暫。

比較方法學(xué)驗證的3種方法可以得出以下結(jié)論，通過增加沖洗液量可以消除樣品的抑菌性，但會損害濾膜、損傷微生物。而采用加入中和劑的方法，不但能消除抑菌性，而且減少了無菌檢查的沖洗量，縮短無菌檢查時間，降低檢查過程中的污染概率，特別是當檢驗量增加時，加入中和劑操作簡便、耐用性好。方法學(xué)驗證Ⅰ顯示在不加入中和劑的情況下，實驗組中的黑曲霉和白色念珠菌均能正常生長，表明樣品對真菌抑菌性較弱或者在該檢驗條件下已經(jīng)能消除樣品的抑菌性，因此在改良馬丁培養(yǎng)基中可以不添加中和劑。

4 結(jié)論

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（0.5g／100m l）的無菌檢查可以采用如下方法：取規(guī)定量供試品，按照薄膜過濾法過濾，然后用0.1%蛋白胨水溶液沖洗（300m l／管），最后加入含0.2mol／L Mg2＋的培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基中可不加中和劑）。

［1］ 陳新謙，金有豫，湯 光.新編藥物學(xué)［M］.17版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：97.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版二部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄105.

［3］ 尤啟東.藥物化學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：418.

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Establishment and validation of sterility test of levofloxacin lactate and sodium chloride injection

LIU Dong，TANG Changm ing，HAO Zhe（Department of Pharmacy，No.153Central Hospital of PLA，Zhengzhou 450042，China）

ObjectiveTo establish a sterility testof levofloxacin lactate and sodium chloride injection.MethodsThe test was carried out by thin-membrane filtrationmethod with different volume of flushing liquid or adding neutralization into culture medium according to the Appendix of Chinese Pharmacopoeia（2010edition）.ResultsWhen 0.1%peptone water was used as flushing liquid，Staphylococcus aureus gave no evidence of grow th until the amount of flushing liquid reached 700m l per tube（100m l each time）.A t the same time，all of the six positive control bacteria grew normally when there was 300m l flushing liquid in each tubew ith neutralization as culturemedium.Conclusion Thismethod was simple and convenient，suggesting that itwas suitable for the sterility test of levofloxacin lactate and sodium chloride injection.

levofloxacin lactate；injection；sterility test

R978.1；R927.11

A

1006-0111（2015）06-0552-03

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.019

2014-03-29

2014-09-01［本文編輯］李睿旻

劉 棟，碩士，藥師.研究方向：醫(yī)院制劑.Tel：（0371）60653569；E-mail：liudong13673546650＠163.com

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