炭疽桿菌表面四糖抗原全合成的研究進展

黃 蕾，許克寒，吳俊琪，姚 闊，俞世沖，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學藥學院有機化學教研室，上海 200433）

·綜述·

炭疽桿菌表面四糖抗原全合成的研究進展

黃 蕾，許克寒，吳俊琪，姚 闊，俞世沖，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學藥學院有機化學教研室，上海 200433）

炭疽是由炭疽桿菌引起的人畜共患的傳染病。炭疽桿菌屬于需氧芽孢桿菌屬，為G＋菌，其病原體是芽孢。炭疽芽孢最外層含有特定結構的四糖抗原，可用于制備糖綴合物疫苗，誘導免疫反應。綜述近10年來文獻報道對炭疽四糖化學合成的研究進展，并結合國內外最新研究成果介紹各條制備路線，比較各種方法的主要優(yōu)缺點。

炭疽四糖；糖基化；化學合成

1 前言

炭疽是由炭疽桿菌引起的人畜共患的傳染病。炭疽桿菌為致病菌中最大的G＋菌，屬于需氧芽孢桿菌屬［1］。該菌在宿主體內形成莢膜，莢膜具有很強的致病性和抗吞噬作用。炭疽桿菌在體外可形成芽孢，芽孢具有很強的抵抗力，可在動物尸體及土壤中存活數十年［2］。一旦它進入人體，炭疽芽孢便會迅速繁殖并釋放出毒力很強的外毒素和莢膜物質，引起組織水腫、出血和壞死，使人喪失勞動力，直至死亡。該菌具有強大的殺傷力，能夠承受惡劣的生長環(huán)境，并且易于擴散，炭疽孢子在歷史上曾被許多國家和恐怖組織用于制造大規(guī)模殺傷性武器。目前治療炭疽的首選藥物是抗生素，然而炭疽毒素對抗生素并不敏感，所以對于中晚期炭疽患者，臨床醫(yī)生幾乎束手無策［3］。由此可見，有效的抗炭疽疫苗具有重大的臨床價值［4］。

由于糖基化是生命過程中普遍存在的現象，而承載重要生物學功能的糖綴合物的糖鏈在病理過程中的異常和高表達以及異種生物糖鏈的特異性，使糖類化合物作為抗原決定簇而引起特異性免疫反應?；诖碎_發(fā)的一系列常用寡糖疫苗［5］能夠在感染的早期階段起到滅活細菌的作用，并在臨床實踐中被證實是有效和安全的。另外，癌癥［6］、瘧疾［7］和b型流感病毒［8］等的寡糖疫苗合成工作也已取得了令人鼓舞的進展。

2004年，Turnbough報道了炭疽芽孢表面四糖抗原anthrose（圖1）的特異性結構：由3個L-鼠李糖和一個D-單糖組成，且含有一個非還原性末端［9］。炭疽四糖1結構的闡明，為發(fā)展炭疽疫苗提供了新的靶標抗原和分子基礎。炭疽芽孢最外層上的寡糖抗原具有高度保守性結構和免疫應答的可靠性［9］，可與不同的蛋白載體結合，用于開發(fā)新型的糖綴合物疫苗［10］。由于細胞表面的寡糖往往難以由分離得到，所以尋找有效的炭疽四糖1及其類似物的化學合成方法尤為重要。本文綜述近10年來對炭疽四糖化學合成研究進展的文獻報道，并結合國內外最新研究成果，介紹了各條路線的制備機制，比較了各種方法的主要優(yōu)缺點。

圖1 炭疽四糖1、2、3、5的化學結構式

2 合成路線

2.1［2＋2］路線 2005年9月，Seeberger［11］報道采用［2＋2］的策略首次合成了anthrose類似物炭疽四糖2（圖1）。炭疽四糖2的末端含有戊烯基，在開發(fā)疫苗過程中可作為連接點綴合載體蛋白。此路線（圖2）以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，分別修飾成單糖中間體11、12、13和14。單糖13和14在三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）催化下，糖基化后與吡啶反應脫去Fmoc基團得二糖中間體16。單糖11和12在TMSOTf催化下進行β-選擇性糖基化后，在MeI／Ag2O催化下甲基化得二糖中間體15。二糖中間體15在TMSOTf催化下與Cl3CCN、NaH反應得二糖中間體17。二糖中間體16和17在TMSOTf催化下糖基化，［2＋2］耦合得四糖中間體18。最后，四糖中間體18與液氨中的鈉反應脫去所有的永久保護基團，疊氮部分轉化成胺，得目標產物。合成路線總體步驟較短，相對快捷，方便獲取類似物和短序列；但由于D-巖藻糖價格較貴，并不適合實際生產應用。

2.2以鼠李糖和葡萄糖為原料的［1＋3］路線 2005年10月，Kovac［12］課題組，報道采用［1＋3］的策略合成了anthrose類似物炭疽四糖苷3（圖1）。炭疽四糖苷3的末端側鏈，可用于綴合蛋白質或其他合適的載體。此路線（圖3）以L-鼠李糖和D-葡萄糖為原料，分別制得單糖受體19、單糖供體20和單糖供體25。前兩者在NIS，AgOTf條件下糖基化得二糖中間體21。二糖中間體21脫保護成二糖受體22，再次與單糖供體20糖基化得三糖中間體23。三糖中間體23在甲醇鈉條件下脫保護成糖基受體24。單糖供體25與糖基受體24在NIS、Ag-OTf條件下糖基化，經［1＋3］耦合成四糖中間體26。最后，四糖中間體經過連續(xù)甲基化、氫解脫芐基等步驟即得目標產物。由于炭疽四糖3上存在2-甲氧基，為了保證高度立體選擇性，線路中使用了2-O位無鄰基參與的糖基供體進行糖基化，但是此反應條件極其不易控制，并且降低了產率。1年后，Adamo小組運用同一思路，進一步合成了糖配體28、29和30（圖4）［13］。這些糖配體的鼠李糖末端均含有與炭疽四糖苷3相同的子結構單元，可通過不同方式結合蛋白質形成糖綴合物。

圖2 Seeberger的工作

圖3 Kova c的工作

圖4 Ad amo的工作

2.3 基于非糖原料的［1＋3］ 路線 2007年，Guo［14］報道使用［1＋3］從頭不對稱合成策略合成炭疽四糖1（圖5）。第一步，先用乙酰呋喃合成重要的吡喃酮中間體8，再由吡喃酮中間體31得到D-單糖中間體32、33和鼠李糖受體34。在鈀催化條件下，鼠李糖受體34上的C-2位羥基與中間體31糖基化結合成中間體35。中間體35經Luche還原羥化后進行乙酰化保護，得到鼠李二糖受體36。鼠李二糖受體36如上述流程疊加成鼠李三糖中間體37。鼠李三糖中間體37先經還原羥化并?；Ｗo后得鼠李三糖中間體38。在TMSOTf催化下，鼠李三糖中間體38與單糖中間體32或33結合成四糖中間體39。最后，四糖中間體經甲基化、脫保護等步驟轉化為目標產物?？偮肪€共計25步，總產率為13%。盡管不再使用價格較貴的鼠李糖和巖藻糖為原料，創(chuàng)新性地選擇了價格便宜的乙酰呋喃以降低成本，但步驟較繁雜，犧牲了效率。隨后，Guo延續(xù)這一思路進一步合成了末端具有疊氮基團的炭疽四糖類似物5（圖1）［15］，以便綴合載體蛋白。

2.4 以鼠李糖和半乳糖為原料的［1＋3］路線 同為2007年，Crich［16］課題組報道采用［1＋3］策略合成了反式糖苷鍵連接athrose末端部分的炭疽四糖2（圖6）。以D-半乳糖和L-鼠李糖為原料分別合成單糖供體44、鼠李糖供體41、鼠李糖受體42和鼠李糖受體40。鼠李糖供體41與鼠李糖受體42在Ph2SO，TTBP，Tf2O，－60℃條件下糖基化結合后加保護成二糖中間體43。取二糖中間體43的β-型體與鼠李糖受體40在相同條件下糖基化后脫保護成鼠李三糖受體45。鼠李三糖受體45與單糖供體44仍采用相同的方式進行糖基化結合，得四糖中間體46。最后選擇β-構型四糖中間體46，進行相應的脫保護步驟修飾成目標產物。此路線使用了較少的基團保護操作，增加了合成的效率，同時適當降低了原料成本。

2.5 以鼠李糖和巖藻糖為原料的［1＋3］路線 2011年，Wang［17］小組報道采用［1＋3］的策略合成炭疽四糖6（圖7）。此路線以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，修飾成單糖受體47、單糖中間體48和單糖供體49。將單糖中間體47置于［Ir（COD）（PMePh2）2］PF6條件下異構化成相應的1-丙烯基的糖基供體，與單糖受體2NIS／TfOH條件下糖基化后經堿處理得二糖中間體50。二糖中間體50使用相同方式依次將單糖受體47和單糖受體49糖基化結合組成四糖中間體52。最后，四糖中間體經后續(xù)脫保護等修飾工作得目標產物。路線中所用的兩階段活化烯丙基糖基供體的糖基化方法避免了耗時的末端基團保護和純化步驟，縮短了反應路線。對于寡糖的合成，不需要任何保護和脫保護屬性調整，顯著簡化了中間體的制備，并全面提高了合成效率。但原料中的D-巖藻糖價格較貴，且使用了價格比較昂貴的促進劑，成本較高，不適合實際投產。

2012年，Grandjean［18］課題組報道采用［1＋3］策略合成了炭疽四糖類似物8（圖8）。此路線以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，得到單糖中間體53、單糖受體54、單糖供體55和單糖供體59。單糖受體53與單糖中間體54在NIS，AgOTf催化下糖基化結合后選擇性脫保護得二糖受體56。二糖受體56與單糖供體55經Schmidt′s糖基化得三糖57。三糖57近一步脫保護修飾成三糖受體58。三糖受體58與單糖供體59在TMSOTf條件下糖基化耦合得四糖60。最后，四糖60經常規(guī)甲基化、氫解脫芐基保護等步驟得目標產物。隨后，Grandjean延續(xù)此思路進一步合成了炭疽四糖的環(huán)狀硫酸酯中間體——去甲基化的二糖衍生物9（圖9）。相關免疫學活性研究表明，雙糖結合到牛血清白蛋白（BSA）能夠誘導抗原四糖的IgG抗體反應，可以在一個糖結合物的抗原制劑中使用［19］。

圖5 Gu o的工作

3 結論與展望

綜上所述，炭疽四糖的化學合成已取得了顯著進展，同時也存在諸多不足。這些路線多是使用傳統(tǒng)糖類（碳水化合物）作為前體來繪制其立體化學構型，如昂貴的D-巖藻糖、D-半乳糖，或不常見的L-鼠李糖。從頭不對稱合成所使用的原料乙酰呋喃，雖然價格低廉，但其合成步驟復雜，效率低。為了節(jié)約步驟，在鼠李寡糖糖基化反應中，Kovac、Crich和Wang小組都選擇了無鄰基參與的α-連接。然而由于沒有相鄰的基團參與，立體選擇性幾乎完全依賴于糖基化條件的確定，目前只有Kovac小組能夠較好地控制反應條件。

圖7 Wa n g的工作

圖8 Gr and j ean的工作

圖9 二糖衍生物9

炭疽桿菌的檢測及新型糖綴合物炭疽疫苗的研發(fā)迫切需要炭疽四糖載體蛋白偶聯物的大量合成。與蛋白合成相比，糖類合成的難點在于有更多的功能基團需要保護與去保護，且為了區(qū)分這些相似的官能團，保護和去保護的方法必須具有很好的選擇性和專一性；更重要的是，糖苷鍵的形成還應具有較好的立體選擇性，并且在后續(xù)合成中要保持其構型不變，這些因素都是限制多糖合成的主要原因。經過科學家們不懈的努力，化學合成寡糖的能力和速度已有較大提高，尤其是一些新型保護基、新技術及新策略的出現和應用為復雜寡糖的合成開拓了廣闊前景。實現炭疽四糖的大規(guī)模合成指日可待。由于炭疽四糖及其衍生物結構的極大差異性和復雜性，各種合成過程中的分離方法還難以達到令人滿意的效果。因此，不斷完善有效的炭疽四糖及其衍生物的合成方法仍是當前的迫切需求。

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Research progress in the synthesis of antigen Bacillusanthracis tetrasaccharide

HUANG Lei，XU Kehan，WU Junqi，YAO Kuo，YU Shichong，WU Qiuye（Depar tment of Organic Chemist ry，School of Pharmacy，Second M ilitary Me dical Un iversity，S hanghai 200433，China）

ObjectiveAnthrax is an anthropozoonosis caused by the bacterium Bacillusanthracis.Bacillusanthracis is an aerobic，spore-forming，rod-shaped bacterium，which infects human through ingestion or inhalation of the spores.Theexosporium of spores of Bacillusanthracis contains tetrasaccharide antigen w ith specific chemical structure，which can be used in preparation of glycoconjugates vaccines，inducing an immune response.This paper reviewed articles in the last decade that reported research advances in chemical synthesis of anthrax tetrasaccharide，presented themethods for synthesis，and compared the advantages and lim itations among differentmethods.

anthrax tetrasaccharide；glycosylation；chemosynthesis

O621.3；R378.72

A

1006-0111（2015）06-0481-06

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.001

2014-04-03

］ 2014-07-11［本文編輯］李睿旻

國家科技重大專項（No.2012ZX09502001-005，2011ZXJ09201-012），國家自然科學基金青年項目（No.21202200），第二軍醫(yī)大學藥學院大學生科研訓練計劃項目

黃 蕾，碩士研究生.Tel：13062669850；E-mail：huanglei0026＠163.com

吳秋業(yè)，教授.研究方向：抗真菌、抗腫瘤藥物、寡糖及其他天然產物的全合成研究.Tel：（021）81871225；E-mail：qyw u2008＠163.com